Enzymatische spijsvertering en handmatige dissociatie: een methode om C. elegans-embryo's voor celcultuur te bereiden

Samenvatting

Bron: Sangaletti, R. and Bianchi, L. A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells. J.Vis. Exp. (2013). 

Deze video introduceert een methode om embryonale C. eleganscellen in vitro te isoleren en steriel te gekweekt.

Protocol

1. Embryonale cellen dissociatie

1. Voer de volgende stappen van de procedure uit onder steriele omstandigheden met behulp van een laminaire stroomkap. Terwijl dieren toga op bacteriënplaten zijn, moeten de wasbeurten en de behandeling met de lysis-oplossing die bleekmiddel bevat, de meeste, zo niet alle bacteriën elimineren. Zo voorkomt het gebruik van een laminaire kap op dit punt van de procedure nieuwe verontreiniging van de eisuspensie.
2. Resuspend gepelde eieren in 1 ml chitinase van 2 mg/ml (bouillon in eibuffer pH 6,5) en breng ze over in een nieuwe steriele conische buis van 15 ml. Schommel de buis gedurende 10-30 minuten op kamertemperatuur. De exacte incubatietijd verandert afhankelijk van de versheid van het enzym en de temperatuur van de kamer en moet daarom voor elk preparaat worden bepaald. Het wordt aanbevolen om na 10 minuten incubatie te beginnen met het controleren van de eieren onder een omgekeerde celkweekmicroscoop. Opmerking: onze ervaring is dat een lage pH de chitinase enzymatische activiteit verhoogt. Om deze reden gebruiken we eibuffer bij pH 6,5 om chitinase op te lossen (recept hierboven vermeld, waarbij de pH wordt aangepast naar 6,5 met NaOH).
3. Wanneer ~ 80% van de eierschalen worden verteerd door de chitinasebehandeling(figuren 1 A-B),pellet de eieren door centrifugeren bij 900 x g (~ 2.500 tpm) gedurende 3 minuten. Verwijder met behulp van een P1000 pipettor en steriele uiteinden voorzichtig het supernatant en voeg 3 ml L-15 medium toe.
4. Breng de eieren over in een plaat met een diameter van 6 cm en dissocieert de cellen voorzichtig met een steriele spuit van 10 ml die is uitgerust met een naald van 18 G. Controleer de mate van dissociatie door een druppel suspensie in een verse plastic petrischaal te plaatsen en door onder de microscoop te kijken. Aspireer tijdens deze procedure geen lucht in de spuit om beschadiging van cellen te voorkomen. Ga door met de dissociatie totdat ~ 80% van de cellen zijn gedissocieerd.
5. Filtreer de suspensie met een steriel Millipore-filter van 5 μm. Celsuspensingen moeten worden gefilterd om celklonters, onverteerd eieren en uitgebroede larven te verwijderen. Filtreer extra 4-5 ml verse L-15 media door het filter om alle cellen te herstellen. Gebruik geen overmatige kracht tijdens de filtratiestap om beschadiging van het filter en/of de cellen te voorkomen.

2. Cultiverende cellen

1. Pellet de gedissocieerde cellen door centrifugeren bij 900 x g (~ 2.500 tpm) gedurende 3 min. Verwijder met behulp van een P1000 pipettor en steriele tips voorzichtig al het supernatant. Resuspend de pelleted cellen in volledige L-15 medium en plaat 1 ml/goed. De hoeveelheid van het toegevoegde medium hangt af van het aantal gebruikte 8P-platen, de samenvloeiing van de wormen op de platen en het type experimenten dat op de cellen zal worden uitgevoerd. De celdichtheid kan worden bepaald met behulp van een hemocytometer. Voor patch-clamp opnames is de platingdichtheid van ~ 230.000 cellen/cm² optimaal.
2. Bewaar de 24 puttenplaat in een plastic Tupperware-container met natte papieren handdoeken om verdamping van kweekmedium te voorkomen. Bewaar de container in een bevochtigde incubator bij 20 °C en omgevingslucht.
3. De cellen zijn meestal binnen 24 uur klaar voor de experimenten wanneer de morfologische differentiatie en expressie van GFP-markers zijn voltooid. Cellen kunnen tot 2 weken in cultuur worden gehouden, maar ze zijn meestal het gezondst tot 7-9 dagen na plating. Het medium moet eenmaal per dag worden vervangen om gezonde cellen te behouden.

Resultaten

Figuur 1. C. elegans embryo's voor en na chitinase behandeling. A) Foto van eieren vóór blootstelling aan chitinase. De pijl wijst naar de transparante en intacte eierschaal rond een embryo. (B) Eieren behandeld met chitinase gedurende 10 minuten. De eierschalen zijn verteerd en zijn niet meer zichtbaar rond de embryo's. De pijlen wijzen naar dr...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
<strong>REAGENTS</strong>
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
<strong>EQUIPMENT</strong>
101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator