Nieuwe tankduiktest: een methode om aangeboren stressreacties bij zebravissen te bestuderen

Samenvatting

Bron: Chin J.S.R., et al. Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish. J.Vis. Exp. (2019)

Het artikel beschrijft een gedragsmethode om stress bij zebravissen te beoordelen. Als reactie op stress hebben zebravissen de neiging om op de bodem van een tank te zwemmen totdat stress is verwijderd. Het voorbeeldprotocol beschrijft stapsgewijze methode voor het uitvoeren van de test.

Protocol

1. Nieuwe tanktestopstelling

1. Bereid een bekerglas van 250 ml voorgevuld met vissysteemwater en ten minste twee houdtanks.
2. Breng op de ochtend van de test ten minste 10 volwassen zebravissen over die voor elke experimentele aandoening (controles en experimentele volwassenen) moeten worden gebruikt, van de visfaciliteit naar een opslagtank, breng ze over naar de gedragsruimte en laat ze ten minste een uur acclimatiseren.
   OPMERKING: Een machtsanalyse moet worden uitgevoerd voordat wordt geëxperimenteerd, maar in onze handen is een n = 10 meestal voldoende om statistische significantie te detecteren. Bovendien mag de bewaartank niet meer dan vijf personen per liter water bevatten. Een acclimatisatie van een uur is voldoende omdat is aangetoond dat zebravisvolwassenen binnen 30 minuten na een nieuwe tank wennen. Ook worden gedragsritmes beïnvloed door circadiane processen, en daarom moeten experimentele replica's die op verschillende dagen worden uitgevoerd binnen dezelfde uren worden uitgevoerd. We voeren meestal alle experimenten uit tussen 11:00 en 18:00 uur.
3. Etiketteer de tanks zodanig dat de toestand of het genotype van de dieren blind is voor de experimenteerder.
   OPMERKING: Experimenten kunnen gemakkelijk aan de experimenteerder worden verblind door tanks te labelen met behulp van een letter- of cijfersysteem (d.w.z. de ene tank heeft het label 'A', de andere 'B', enz.). Een partij die niet betrokken is bij de experimenten labelt de tanks met een dergelijk systeem en maskeert de identiteiten van de experimenteerder totdat de na-analyse is voltooid.
4. Plaats met behulp van een net voorzichtig een enkele volwassene in het voorgevulde bekerglas vanaf stap 1.1. Laat de volwassen vis 10 minuten acclimatiseren in het bekerglas.
   OPMERKING: Noteer het geslacht van de volwassene, omdat het na de analyse belangrijk kan zijn om te zoeken naar seksespecifieke verschillen.
5. Na acclimatisatie in het bekerglas, introduceer de vis in de nieuwe tank (stel details hieronder op) door het water en de volwassene voorzichtig uit het bekerglas te gieten.
   OPMERKING: De stappen in deze sectie beschrijven het instellen van de nieuwe tanktest. Figuur 1Bgeeft een diagram van het eindproduct .
   1. Plaats de nieuwe tank in het midden van de tafel.
   2. Plaats de infraroodlampen achter de tank en plaats de witte acrylplaat of het diffusorscherm tussen de tank en de LED-lichtbron.
   3. Plaats de diffuser zo dat deze het licht van de LED's maximaal verspreidt en de intensiteit van het licht voldoende is om de nieuwe tank te verlichten. Hoe dichter het bord bij de lichtbron is, hoe helderder de lichten zullen zijn, maar hoe minder het zal diffuus worden. Door de diffusorplaat daarentegen uit de buurt van de lichtbron te plaatsen, vermindert u de lichtintensiteit, maar verspreidt u het licht beter.
   4. Vul ongeveer driekwart van de nieuwe tank met vissysteemwater.
      OPMERKING: Systeemwater wordt gegenereerd met behulp van omgekeerde osmose van leidingwater, gevolgd door een dosering die gelijk is aan 900 ± 100 μS, dat de pH neutraal is (7,2) en dat de temperatuur 27 ± 1 °C is.
   5. Bevestig de camera aan de camerastandaard en sluit de camera aan op de computer. Open de video-acquisitiesoftware en stel de camera in om naar de voorkant van de tank te kijken en ervoor te zorgen dat de hele nieuwe tank te zien is en dat er geen verborgen gebieden in de video zijn. Stel de tank en de infraroodlampen zo in dat er voldoende en gelijkmatige verlichting in de hele tank is wanneer deze door de camera wordt waargenomen.
      OPMERKING: Voordat u doorgaat met experimenten, kan het vaak nuttig zijn om een proefrun uit te voeren, waarbij video van een vis wordt vastgelegd en tracking wordt uitgevoerd. Dit zorgt ervoor dat de installatie voldoende is voor het experimenteren met gedrag.
6. Nadat u de volwassene in de nieuwe tank hebt geïntroduceerd, start u de camera-opname en gaat u weg van de opstelling om extra nood aan de vis te voorkomen.
7. Nadat de opname is voltooid, verwijdert u het individu uit de nieuwe tank en plaatst u het in een nieuwe opslagtank.
   OPMERKING: Een andere houder dan die in stap 1.2 moet worden gebruikt om herhaalde tests op dezelfde personen te voorkomen.

Resultaten

Figuur 1. Diagram van de nieuwe tankopstelling. (A) Afmetingen van de trapeziumvormige nieuwe tank van 1,8 L, gezien vanaf de opnamezijde van de tank. (B) Schema van de opstelling inclusief posities van de infraroodlampen, camera en barrières die worden gebruikt om menselijke interferentie te minimaliseren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Camera 			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter 	Edmund Optics
Video Acquisition Program  			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank 	Aquaneering 	Part number ZT180 	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software 			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology