Gen functie kan worden verduisterd in de verlies-van-functie experimenten als er sprake is compensatie door een ander gen. De zebravis model biedt een relatief high-throughput middel om dergelijke functionele redundantie onthullen in levende embryo's.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gene functie tijdens de embryogenese wordt meestal bepaald door het verlies-van-functie experimenten, bijvoorbeeld door middel van gerichte mutagenese (knock-out) in de muis. In de zebravis model, doeltreffende omgekeerde genetische technieken die zijn ontwikkeld met behulp van micro-injectie van gen-specifieke antisense morpholinos. Morpholinos doel een mRNA via specifieke base-pairing en blokkeren genfunctie tijdelijk door het remmen van vertaling of splitsen voor meerdere dagen tijdens de embryogenese (knockdown). Echter, in gewervelde dieren zoals muizen of zebravissen, kunnen sommige genfuncties worden gestoord door deze benaderingen door de aanwezigheid van een ander gen, dat compenseert het verlies. Dit geldt vooral voor gen-families met zus genen die co-uitgedrukt in dezelfde ontwikkelen van weefsels. In de zebravis, kan functionele compensatie worden getest in een relatief high-throughput wijze, door co-injectie van morpholinos die zich richten op knockdown van beide genen tegelijk. Ook met behulp van morpholinos, kan een genetische interactie tussen twee genen worden aangetoond door knockdown van beide genen samen op sub-threshold levels. Kan bijvoorbeeld morpholinos worden getitreerd zodanig dat noch individuele knockdown een fenotype genereert. Als onder deze omstandigheden, co-injectie van beide morpholinos veroorzaakt een fenotype, is een genetische interactie getoond. Hier laten we zien hoe de functionele redundantie show in het kader van twee verwante GATA transcriptiefactoren. GATA factoren zijn essentieel voor de specificatie van cardiale voorlopercellen, maar dit is alleen onthuld door het verlies van zowel Gata5 en Gata6. We laten zien hoe het uitvoeren van micro-injectie experimenten, valideren morpholinos, en evalueren van het gecompenseerde fenotype voor cardiogenese.
Protocol
Ons doel hier is om de functionele redundantie van twee transcriptiefactoren test voor de specificatie van cardiomyocyt voorouders. De factoren worden gecodeerd door de twee verwante genen gata5 en gata6 en we gebruiken de zebravis model van hun relatieve functies 1 te begrijpen. Onze strategie is het blokkeren van gen-functie met behulp van morpholinos 2. We zullen injecteren morpholinos voor de ene of de andere gen in de bevruchte eieren, en vergelijk de embryonale fenotype met embryo's van eieren gelijktijdig geïnjecteerd met beide morpholinos. Ter vereenvoudiging van de evaluatie van de fenotypes, gebruiken we eieren af....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In het experiment hier beschreven, combineerden we twee morpholinos, die elk alleen al het genereren van een duidelijke reeks van fenotypen, en vond een heel ander fenotype toen ze samen waren co-injectie. Uiteraard moesten we een rechtvaardiging voor het doen van dit experiment in de eerste plaats. We vermoedden dat de twee genen kunnen elkaar compenseren voor een eerdere functie, in dit geval hart-specificatie. Dit komt omdat de genen zijn zeer verwant (en in staat te binden aan dezelfde DNA-sequenties) en worden uitg.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken de leden van de Evans laboratorium voor hun hulp bij de voorbereiding van deze presentatie. De morpholinos hier gebruikt werden oorspronkelijk gevalideerd door dr. Audrey Holtzinger. TE wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (HL064282 en HL056182). Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Institute for Animal Care en gebruik Comite dat is ingesteld, van het Weill Cornell Medical College.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Kweekbakken en scheidingswanden voor vissen | Aquatic Habitats | ||
| Visnetten | Aquatic Habitats | ||
| Systeemwater | 60mg Instant Ocean” per liter dH2O | ||
| 100mm Petri-schalen | BD Biosciences | 351029 | |
| Micropipet-naaldtrekker | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| 3.5" glazen capillairen | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Scheermesje | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| Microslijper | Narishige International | EG-4 | |
| Microscoopoculair met raster | Premiere | MF-02 | |
| Micrometer | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Spatel | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Weegschaal | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| Wegwerpbare weegschaaltjes | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| Conventionele magnetron | GE Healthcare | ||
| Erlenmeyer-kolf | Corning | 4980 | |
| Microscoopglazen | Fisher Scientific | 12-552 | |
| Maatkolf | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| Automatische pipetman | BrandTech | 2026333 | |
| 70% ethanol wassoplossing | Tarr | 801VWR | |
| N2-cilinder | Tech Air | ||
| Micro-injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | |
| Dissectiemicroscoop | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Parafilm | American National Can | PM-992 | |
| Minerale olie | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| gata5 ATG-blokker | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| gata6 Long Isoform ATG-blokker | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| Wegwerpbare Pasteur-pipet | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Tricaine-methansulfonaat | Argent Labs | MS-222 | |
| Methylcellulose | ICN Biomedicals | 155495 | |
| Warmteblok | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| Scherpe pincet | Dumont | Maat 55 | |
| Micro-objectglazen met kuiltje | VWR international | 48339-009 |
Referenties
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
