Transductie naar label PDX-tumorcellen: introductie van lentivirus dat fluorescerende marker uitdrukt in de tumorcel in vitro

In dit artikel

Samenvatting

Bron: Hanna, C., et al. Labeling van borstkanker patiënt-afgeleide xenografts met traceerbare reporters voor tumorgroei en metastase studies. J. Vis. Exp. (2016).

De volgende video beschrijft een techniek van transductie naar label (patiënt-afgeleide xenografts) PDX-tumorcellen, die wordt gebruikt voor het introduceren van lentivirus dat groen-fluorescerend eiwit en luciferase-verslaggevers in vitro in de tumorcel uitdrukt.

Protocol

1. Transductie van PDX-afgeleide tumorcellen

Centrifugeer gedissocieerde tumorcellen op 300 g x 5 min en resuspend in 2 ml mammosfeermedia. Tel levensvatbare cellen met behulp van trypanblauwe uitsluiting (Geresuspendeerde verteerd cellen in 5 ml wasbuffer en tel zowel levensvatbare als niet-levensvatbare cellen met behulp van trypanblauwe uitsluiting. Meng kort 50 μl cellen en 50 μl trypanblauw en tel trypanblauw exclusief cellen met behulp van een hemocytometer).
Bereid 10 ml mammosfeermedia met 8 μg/ml polybreen (2 μl stampolybreen per ml media).
Bepaal het volume dat nodig is voor 2 x 10⁵ levensvatbare tumorcellen. Centrifugeer cellen op 300 x g gedurende 5 min en resuspend pellet in 2 ml polybreen bevattende media. Plaat 2 x 10⁵ levensvatbare tumorcellen per put in een 6-put ultra-lage hechting weefselkweekplaat.
OPMERKING: Dit is een optimaal aantal cellen dat nodig is voor transductie met één lentivirale vector.
LET OP! Lentivirale deeltjes en alle verbruiksgoederen die met lentivirale deeltjes worden gebruikt, moeten worden behandeld volgens institutionele procedures voor recombinante DNA-biogevaarlijke deeltjes.
OPMERKING: Lentivirale transductie van primaire borstcellen bevordert sterk myoepitheliale cellen, wat kan resulteren in een slechte etikettering van luminale cellen en selectie van subpopulaties van tumorcellen tijdens het labelen.
Incubeer het virus met neuraminidase van 200 mU/ml bij 37 °C gedurende 1 uur voorafgaand aan transductie om de binding van virale deeltjes aan verschillende subpopulaties van primaire cellen te verhogen en correct voor deze potentiële bias.
Voeg lentivirale deeltjes toe bij 10 MOI (2 x 10⁶ TU voor 2 x^{10 5} levensvatbare cellen) als PDX-gedissocieerde cellen zijn uitgeput uit Lin+ muiscellen of verrijkt in EpCam+ cellen. Voeg lentivirale deeltjes toe bij 30 MOI (6 x 10⁶ TU voor 2 x 10⁵ levensvatbare cellen) bij gebruik van niet-verrijkte PDX-gedissocieerde cellen.
OPMERKING: De verhoogde MOI zorgt voor efficiënte transductie, zelfs in de aanwezigheid van grote hoeveelheden puin en dode cellen in ruwe extracten. Houd er een goed met ongelabelde cellen om te dienen als een controle voor levensvatbaarheid en transductie-efficiëntie.
Werveling om virus met cellen te mengen. Incubeer bij 37 °C, 5% CO₂ tot 96 uur. Voeg 24 uur na transfectie 500 μl verse mammosfeermedia toe. Cellen hechten zich niet aan platen, aspireren geen media.

2. Evaluatie van transductie-efficiëntie en re-implantatie van gelabelde cellen bij immuungecompromitteerde muizen

Controleer de expressie van de traceerbare marker (GFP) elke 24 uur met behulp van een fluorescerende microscoop bij 10x vergroting.
OPMERKING: GFP-expressie kan al 24 uur na infectie worden waargenomen, maar in de meeste PDXs is GFP-expressie duidelijk zichtbaar na 72 uur (figuur 1).
Schat de efficiëntie van transductie door het percentage GFP+ cellen binnen de totale put te evalueren.
OPMERKING: Omdat culturen tumorcellen, resterende stromale cellen en dode cellen in verschillende mate bevatten, kunnen putten met slechts 10% GFP + -cellen in een gastheermuis worden geïmplanteerd.
Breng getransduceerde cellen van 6-putplaten over in een conische buis van 15 ml. Voeg 1 ml mammosfeermedia toe aan de put om alle achtergebleven cellen te verzamelen. Plaats op ijs.
Voeg 10 ml HBSS/hepes toe aan getransduceerde cellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min, 4 °C. Aspireer zorgvuldig supernatant en resuspend in 50 μl keldermatrixextract (BME) op ijs.
OPMERKING: BME-aliquots moeten 1 - 2 uur voor gebruik op ijs worden ontdooid. BME zal stollen bij kamertemperatuur; te allen tijde op ijs blijven.
Plaats BME-ingebedde cellen in een insulinespuit van 0,5 ml, blijf op ijs en breng naar de dierenfaciliteit voor herimplanting in NSG-muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

figure-results-1
Figuur 1: Transductie-efficiëntie volgen in gedissocieerde PDX-cellen. A) PDX-gedissocieerde cellen verrijkt voor menselijke epitheelcellen (Lin+ uitputting) 24 uur na transductie met pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro lentivirale deeltjes. B) PDX-gedissocieerde cellen van een afzonderlijk experiment, zonder epitheliale celverrijking, 72 uur na transductie met pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Beid...