India Inktinflatie: een kleuringsmethode om tumorknobbeltjes te visualiseren

Samenvatting

Bron: Paschall, A. V. et al. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (2016).

Deze video beschrijft india inktinflatie --een kleuringsmethode--om tumorknobbeltjes in tumordragende muizenlongen te kwantificeren. Na het kleuren worden de longen bevestigd in fekete's oplossing om tumorknobbeltjes in de longen te observeren.

Protocol

1. Validatie van longmetastasen met behulp van India Inktinflatie van tumordragende longen

OPMERKING: Om de resultaten van luciferase live tumorbeeldvorming te valideren, voert u India-inktinflatie van tumordragende muislongen uit om tumorknobbeltjes te kwantificeren. 4T1-cellen metastaseren ook naar andere organen en weefsels (figuur 1) en daarom moet indien nodig histologisch onderzoek van deze organen worden uitgevoerd om tumormetastasen te valideren. Dit protocol gebruikt longmetastasen als voorbeeld.

1. Houd muizen in hun bestaande thuiskooi voor euthanasie. Wanneer ze bij andere dieren worden gehuisvest, verplaats je die muizen die niet worden geëuthanaseerd naar een andere kooi.
2. Verwijder de bovenkant van het kooifilter en vervang deze door de bovenkant van het CO2-filter. Schakel de gecomprimeerde CO2-gasfles in (100%) die is aangesloten op het CO2-filterblad. Stel het debiet in op 2 L/min en houd CO2 minstens 10 minuten aan. Als de muizen na 10 minuten nog ademen, laat de CO2 dan aan staan tot ten minste 1 minuut nadat de muizen zijn gestopt met ademen. Schakel de CO2-cilinderregeling en de debietmeter uit. Wacht nog 3 minuten en verwijder de filtertop.
3. Plaats de opgeofferde muis op zijn rug op een polystyreen bord. Speld de poten om een onbelemmerde toegang tot de luchtpijp te garanderen. Besproei de muizen met 70% ethanol.
4. Snijd met een schaar langs de middellijn van de middenbuik van de muis door de ribbenkast en omhoog naar de speekselklieren. Let op de luchtpijp. Gebruik een tang om weefsels rond de luchtpijp te verwijderen om de luchtpijp bloot te leggen.
5. Rijg een pipetpunt onder de luchtpijp. Houd de punt met één hand vast en til de luchtpijp voorzichtig op en weg van het lichaam.
6. Draai het platform met de muis 180°. Gebruik een 1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin spuit om India Ink (10% India inkt en 0,1% Ammoniumhydroxide) via de luchtpijp in de longen te injecteren. Blaas de longen volledig op met inkt tot er een sterke weerstand wordt gevoeld.
7. Gebruik een schaar om de luchtpijp te knippen. Gebruik de tang om de muis vast te houden en een andere set tangen onder de longen te plaatsen en de longlobben uit de muis te trekken. Spoel de longen kort af in een beker met water.
8. Breng in een chemische zuurkap de longen over naar een glazen scintillatieflacon met 3 ml Fekete's oplossing (50% ethanol, 6% formaldehyde en 3% ijsazijnzuur). Sluit de flacon af om verdamping van de oplossing te voorkomen.
   OPMERKING: De weefsels kunnen voor onbepaalde tijd in de oplossing van Fekete worden opgeslagen.
9. Observeer na een paar minuten tumorknobbeltjes als witte stippen op de zwarte longen (figuur 1). De witte tumorknule is zichtbaar door de ogen. Breng de longen over in een schaal in een zuurkast en tel het aantal witte vlekken. Elke witte vlek vertegenwoordigt een enkele gemetastaseerde tumorknule.

Resultaten

Figuur 1. Visualisatie van longtumorknobbels door India Ink Inflation. De long van de tumordragende muis werd opgeblazen met India inkt en bevestigd in Fekete's oplossing. De witte stippen zijn longmetastasen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
9 mm AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620