Mechanische dissociatie: een methode om levensvatbare cellen uit een weefsel te verkrijgen

Samenvatting

Bron: Garaud et. al., A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymaticly Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes. Drs. J. Vis. Exp. (2014).

Deze video beschrijft de niet-enzymatische dissociatie van vers menselijk weefsel om levensvatbare cellen te verkrijgen. De techniek wordt gebruikt voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van CD45 positieve cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels.

Protocol

1. Bereiding van het weefselhomogenaat

1. Ontleed geresectiede weefsels (kwaadaardig en normaal weefsel gereseceerd uit de operatiekamer) bevinden zich in het pathologielab door opgeleid personeel voor onmiddellijke pick-up. Tumor, NANT (zo ver mogelijk van de tumor verwijderd) en normale weefselfragmenten worden routinematig verwerkt binnen 1 - 3 uur na chirurgische excisie in een BSL2-laboratorium met behulp van standaard bioveiligheidsprocedures voor menselijke weefsels. Een stroomschema van het protocol wordt geïllustreerd in figuur 1.
2. Weeg alle weefselfragmenten (normaal, NANT en tumor) en meet de lengte, breedte en hoogte (lengte x breedte x hoogte). Dit is een belangrijke stap voor de daaropvolgende normalisatie van celsubpopulaties, geëxtraheerd RNA, enz.
   OPMERKING: Het bereik van de steekproefgrootte is 100 tot 10.000 mm³ zonder vet indien mogelijk.
3. Druk het tumorfragment op een glazen dia voor H&E-kleuring om te controleren of het weefsel daadwerkelijk deel uitmaakt van de tumor.
   1. Doe dit door een glazen microscoopschuif op het tumorfragment te drukken en een paar seconden zachte druk uit te oefenen met uw vingers.
   2. Bevestig de glijbaan met isopropanol gedurende 2 minuten, gevolgd door een wasstap in water. Counterstain het weefsel gedurende 30 seconden met Mayer's hematoxyline.
   3. Was de glijbaan in zes baden water. Vlek in Phloxine B 2% gedurende 15 sec.
   4. Was in één bad water gevolgd door vier baden isopropanol en eindig met één bad water.
   5. Incubeer in isopropanol gedurende 1 min en giet af. Helder in twee baden van xyleen.
   6. Mount met xyleen gebaseerd montagemedium. Onderzoek op tumorcellaliteit (figuur 2).
      OPMERKING: Tumorcellen kleven voornamelijk aan de ingeprente dia - de stromale, lymfoïde of vetcellen blijven zelden achter, waardoor er ruimte overblijft tussen de tumorcellen (figuur 2).
4. Plaats het weefselfragment in een kleine kweekschaal met 1 ml van het chemisch gedefinieerde, serumvrije hematopoëtische celmedium (hierna medium genoemd) op kamertemperatuur en snijd het in kleine stukjes (~1 - 2 mm²) met behulp van een steriele scalpel.
5. Breng alles (weefselfragmenten + medium) over naar een mechanische dissociator C-buis.
6. Spoel de Petrischaal en scalpel af met 2 ml medium met een Pasteur pipet en voeg dit toe aan de C-tube (volume medium voor dissociatie = 3 ml).
7. Gebruik het mechanische dissociatorprogramma A.01 voor C-buizen (het meest zachte programma) om de weefselfragmenten te homogeniseren tot een enkele celsuspensie. Plaats de C-buis in het apparaat en voer het programma twee keer achter elkaar uit (één cyclus = 25 sec).
   OPMERKING: Deze homogenisatieprocedure is vastgesteld en gevalideerd voor menselijk borstweefsel, andere tumor- of weefseltypen moeten mogelijk een ander programma gebruiken en moeten eerst worden getest.
8. Verwijder de C-buis uit het apparaat en decanteer het homogenaat rechtstreeks in een 40 μm celzeef die op een buis van 50 ml zit. Breng met dezelfde Pasteur pipet als in stap 1.6alle vloeistof die overblijft in de C-buis over naar de celzeef.
9. Breng de gefilterde vloeistof over in een buis van 15 ml met behulp van een micropipettip van 1 ml. Houd de celzeef en de buis van 50 ml tijdelijk.
10. Spoel de C-buis af met nog eens 3 ml medium en breng deze, opnieuw met dezelfde Pasteur-pipet als in stap 1.6,over naar de celzeef die nog steeds op de buis van 50 ml zit. Knijp een maximale hoeveelheid van de resterende vloeistof die in het niet-homogeniseerde weefsel is opgesloten in de buis van 50 ml door deze voorzichtig rond de zeef te bewegen met een schone Pasteur pipet of 1 ml punt die vervolgens wordt weggegooid om besmetting van het eluaat te voorkomen.
11. Plaats de celzeef ondersteboven op de originele C-buis en spoel af met 3 ml medium, zodat het niet-gehomogeniseerde weefsel terugvalt in de C-buis.
12. Herhomogeniseer zoals in stap 1.7 voor twee cycli van het A.01-programma.
13. Giet dit tweede homogenaat door de celzeef die op de buis van 50 ml zit, spoel de C-buis opnieuw af met 3 ml medium (zoals in stap 1.10) en breng met de Pasteurpipet over naar de celzeef die op de buis van 50 ml zit en knijp opnieuw een maximale hoeveelheid vloeistof uit het resterende bindweefsel dat in de celzeef zit.
14. Op dit punt bevindt zich een volume van ~ 2,5 ml in de buis van 15 ml en ~ 9 ml in de buis van 50 ml.

2. Scheiding van het weefsel supernatans en cellen

1. Centrifugeer de homogenaten in de tubes van 15 ml en 50 ml gedurende 15 minuten bij 600 x g bij kamertemperatuur.
2. Decanteer de SN uit de buis van 15 ml in een schone buis en bewaar deze tijdelijk bij 4 °C. Deze supernatant = primaire tumor, NANT of normaal weefsel SN (eindvolume 2,5 ml) wordt vervolgens verduidelijkt en aliquoted voorafgaand aan opslag bij -80 °C voor toekomstige analyses (zie hieronder).
3. Gooi het supernatant uit de tube van 50 ml.
4. Resuspend beide celkorrels voorzichtig in een eindvolume van 1 ml medium. Breek kort de celkorrel eerst voorzichtig in beide buizen (door op de buis op een hard oppervlak te tikken). Resuspend de losse celkorrel in de 50 ml met 500 μl medium en breng deze celsuspensie over naar de buis van 15 ml om de tweede pellet te resuspenden. Herhaal deze stap eenmaal met de tweede 500 μl medium voor maximaal herstel van cellen.
5. Breng 10 μl van de celsuspensie over in een kleine buis, meng met 10 μl trypanblauw (verdunning 1:1) en tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer.
   OPMERKING: Op dit punt kan een fractie van de celsuspensie ook worden geanalyseerd door flowcytometrie om de celgrootte, granulariteit en indien gewenst een beperkt aantal subpopulatiemarkers te evalueren voor een nauwkeurigere beoordeling van de relatieve celverdeling in het homogenaat voorafgaand aan uitgebreide analyse of experimenten. Alle analyses per flow cytometrie bevatten CD45-etikettering voor normalisatie van subpopulaties.
6. Pellet de cellen door centrifugeren op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De cellen van de tumor, NANT of normaal weefsel zijn nu klaar voor verdere zuivering of analyse. Deze extra stappen zijn het beste wanneer ze op dezelfde dag als de operatie worden uitgevoerd.
   OPMERKING: Voor flowcytometrische analyse, maar niet voor celsortering, moeten de resterende rode bloedcellen na antilichaametikettering worden gelyseerd door 0,4 ml rode bloedcellysisbuffer aan de celkorrel toe te voegen, onmiddellijk gedurende 1 seconde te vortexen en vóór de analyse minimaal 10 minuten bij kamertemperatuur (beschermd tegen licht) te broeden.

3. Verduidelijking van het weefsel supernatans

1. Centrifugeer de buisjes van 1,5 ml met weefsel SN bij 15.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
2. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet aan te raken of te verstoren. Breng over in een schone buis (of buizen) afhankelijk van het gewenste aantal en volume aliquots.
3. Bewaar het supernatant bij -80 °C voor toekomstig gebruik.

Resultaten

Figuur 1: Protocolstroomdiagram. Onze procedure voor het verwerken van verse menselijke weefsels en enkele analytische benaderingen die vervolgens kunnen worden gebruikt om lymfocyten te beoordelen die menselijke weefsels infiltreren, worden getoond.

Figuur 2: H&E bevlekte afbeelding van een borsttumor w...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GentleMacs Dissociator 	Miltenyi Biotec	 130-093-235	 BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R 	Eppendorf 		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R 	 Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet  	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope 	Nikon eclipse TS100		 or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield  		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer 	Beckman Coulter		 or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube   	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish  	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel   	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm   	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml   	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml  	Becton Dickinson	352097	 or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml  	 Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml   	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml   	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20   	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline   	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue   	VWR	17942E	or other vital stain