Soft Agar Colony Formation Assay: een methode om effecten van nieuwe verbindingen op de proliferatie van kankercellen te testen

Samenvatting

Bron: Horibata A. et. al., Usage of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (2015).

Deze video beschrijft een zachte agar kolonievormingstest om de effecten van een PADI-enzymremmer en BB-Cl-amidine op borstkankertumorigeniciteit in vitrote testen. Deze test maakt ook de kwantitatieve beoordeling van het celtransformatiepotentieel in de context van genetische verstoringen mogelijk.

Protocol

1. Bereiding van 3% 2-Hydroxyethyl Agarose

1. Voeg in een schone, droge glazen fles van 100 ml 0,9 g 2-hydroxyethylagarose (Agarose VII) toe, gevolgd door 30 ml gedestilleerd water.
2. Magnetron het mengsel gedurende 15 sec en wervel voorzichtig. Herhaal deze stap nog minstens drie keer totdat het agarosepoeder volledig is opgelost.
3. Autoclaaf de oplossingsbevattende fles gedurende 15 minuten.
4. Laat de agarose-oplossing afkoelen tot RT voor verder gebruik. Bewaar de oplossing bij RT.

2. Voorbereiding van de onderste laag: 0,6% Agarose Gel

1. Verwarm meerdere pipetten van 5 ml en 10 ml voor in een incubator van 37 °C om te voorkomen dat de agarose tijdens het hanteren stolt in de pipet.
2. Maak het deksel van de fles gedeeltelijk los en magnetron de vooraf gemaakte 3% 2-hydroxyethyl agarose-oplossing gedurende 15 sec. Draai vervolgens de oplossing voorzichtig en magnetron nog eens 15 seconden.
   LET OP: Wees voorzichtig bij het wervelen van de agarose-oplossing, omdat de oplossing opstijgt wanneer deze wordt blootgesteld aan lucht en kan overlopen.
3. Als er nog vaste gel in de fles zit, magnetron dan nog een paar seconden.
4. Bewaar de fles met de agarose-oplossing in een waterbad van 45 °C tijdens de volgende stappen om te voorkomen dat de agarose-oplossing voortijdig stolt.
5. Warme MCF10DCIS-media in een waterbad van 37 °C.
   OPMERKING: MCF10DCIS media bestaat uit DMEM/F12, 5% paardenserum, 5% penicilline streptomycine.
6. Breng 3 ml van de 3% agarose-oplossing met behulp van de voorverwarmde pipetten over in een steriele conische buis van 50 ml.
7. Voeg onmiddellijk 12 ml warme MCF10DCIS-media toe en keer de conische buis voorzichtig om om de agarose met de media te mengen. Probeer geen bubbels te vormen, omdat dit de kolonietelling later zal verstoren.
8. Voeg voorzichtig 2 ml van dit mengsel toe aan elke put van een 6-put kweekplaat zonder luchtbellen te vormen.
9. Incubeer de 6-put kweekplaat horizontaal op een vlak oppervlak bij 4 °C gedurende 1 uur om het mengsel te laten stollen.
10. Nadat het mengsel stolt, plaatst u de plaat gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C. De onderste laag is nu klaar voor gebruik.

3. Bereiding van de celbevattende laag: 0,3% Agarose Gel

1. Probeer MCF10DCIS-cellen te trypsiniseren en te verdunnen tot een celconcentratie van 4 x 10⁴ /ml.
2. Neem 2 ml van de 3% agarose met voorverwarmde pipetten en breng over in een steriele conische buis van 50 ml.
3. Voeg onmiddellijk 8 ml MCF10DCIS-media toe aan de conische buis en keer voorzichtig om om de agarose met de media te mengen. Vermijd het vormen van bubbels.
4. Neem 2 ml van de MCF10DCIS-cellen (4 x 10⁴ /ml) en behandel met BB-CLA (0 μM (DMSO) of 1 μM).
5. Meng in een verdunning van 1:1 de cellen met de 0,6% agarose.
6. Neem 1 ml van het cel-agarosemengsel en voeg voorzichtig toe aan de onderste laag van de 6-put kweekplaat (2 x 10⁴ cellen/ml).
7. Plaats de 6-put kweekplaat gedurende ten minste 15 minuten horizontaal op een vlakke ondergrond bij 4 °C om de toplaag te laten stollen.
8. Nadat het mengsel stolt, plaatst u de plaat een week in een incubator van 37 °C voordat u de voedingslaag toevoegt.

4. Voorbereiding van de feederlaag: 0,3% Agarose Gel

1. Magnetron de vooraf gemaakte 3% 2-Hydroxyethyl agarose oplossing gedurende 15 sec. wervel de oplossing en magnetron nog eens 15 sec.
2. Equilibreert de agarose-oplossingsfles in een waterbad van 45 °C.
3. Verwarm de MCF10DCIS-media in een waterbad van 37 °C.
4. Meng 1 ml 3% agaroseoplossing met 9 ml warme MCF10DCIS-media in een conische buis van 50 ml en keer voorzichtig om om de agarose met de media te mengen. Vermijd het vormen van luchtbellen.
5. Behandel het mengsel met BB-CLA (0 μM (DMSO) of 1 μM).
6. Voeg voorzichtig 1 ml van dit mengsel (zonder bellen te vormen) toe aan elke put van de 6-put kweekplaat met de onderste en zachte lagen.
7. Plaats de 6-put kweekplaat gedurende ten minste 15 minuten horizontaal op een vlakke ondergrond bij 4 °C om het mengsel te laten stollen.
8. Nadat de feederlaag stolt, plaatst u de plaat in een incubator van 37 °C.
9. Herhaal deze voedingsprocedure wekelijks door 1 ml 0,3% agarose/medium/behandelingsoplossing op de bestaande feederlaag te plaatsen om de cellen aan te vullen met nieuwe media totdat kolonievorming wordt waargenomen.
   OPMERKING: Agar in de zachte en feederlagen is erg zacht en daarom zullen de toegevoegde voedingsstoffen uit de feederlaag gemakkelijk diffuus worden in de celbevattende laag om de cellen te bereiken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1