Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Protocol

Reverse transcriptase reactie

Draai verwarming blok naar 70-80 ° C en 42 ° C. Waterbaden kan ook gebruikt worden in deze stap. Bij gebruik van verwarmings-blokken, dus zet wat water dat de warmte uniform is.

1. Priming reactie
   1. Neem 3 pg RNA
   2. Volume aan te passen tot en met 13 ul met RNase vrij water
   3. Voeg 2,5 ul van willekeurige hexameer primers (2mg/mL)
2. Meng goed en incuberen bij 70-80 ° C gedurende 8 minuten. Dan, plaats op ijs gedurende 5 minuten.
3. Bereid RT cocktail (14,5 ul / rxn):
   
   

   Bestanddeel

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP-set PCR-grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR-zuiveringskit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			Om een 1M fosfaatbuffer (KPO4, pH 8.5-8.7) te maken, combineer: 9.5 mL 1M K2HPO4 en 0.5 ml 1M KH2PO4
Fosfaat-wasbuffer	Buffer			Voor 100 mL fosfaat-wasbuffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) meng: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ-water + 84.25 mL 95% ethanol. De wasbuffer zal licht troebel zijn.** BELANGRIJK: Fosfaat-wasbuffer moet dagelijks worden bereid.
Fosfaat-elutiebuffer	Buffer			Verdun 1 M KPO4, pH 8.5 tot 4 mM met steriel water
Natriumcarbonaatbuffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Los 4.2 g NaHCO3 op in 80 mL steriel water en stel de pH in op 9.0 met 10 N NaOH; vul het volume aan tot 100 mL met steriel water. Om een 50 mM oplossing te maken voor de kleurstofkoppelingreactie, verdun deze 1:10 met water. Opmerking: De samenstelling van de carbonaatbuffer verandert na verloop van tijd; maak deze elke paar weken tot een maand opnieuw.