Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Protocol

Reverse transcriptase reactie

Draai verwarming blok naar 70-80 ° C en 42 ° C. Waterbaden kan ook gebruikt worden in deze stap. Bij gebruik van verwarmings-blokken, dus zet wat water dat de warmte uniform is.

1. Priming reactie
   1. Neem 3 pg RNA
   2. Volume aan te passen tot en met 13 ul met RNase vrij water
   3. Voeg 2,5 ul van willekeurige hexameer primers (2mg/mL)
2. Meng goed en incuberen bij 70-80 ° C gedurende 8 minuten. Dan, plaats op ijs gedurende 5 minuten.
3. Bereid RT cocktail (14,5 ul / rxn):
   
   

   Bestanddeel

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-trifosfaat
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR-kwaliteit
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labeling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR-zuiveringskit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			Maak een 1M Fosfaat buffer (KPO4, pH 8,5-8,7) door 9,5 ml 1M K2HPO4 en 0,5 ml 1M KH2PO4 te combineren
Fosfaat wasbuffer	Buffer			Voor 100 mL Fosfaat wasbuffer (5 mM KPO4, pH 8,0, 80% EtOH) meng: 0,5 ml 1 M KPO4 pH 8,5 + 15,25 mL MilliQ water + 84,25 mL 95% ethanol. Wasbuffer zal licht troebel zijn.** BELANGRIJK: Fosfaat wasbuffer moet dagelijks worden bereid.
Fosfaat elutiebuffer	Buffer			Verdunning van 1 M KPO4, pH 8,5 tot 4 mM met steriel water
Natriumcarbonaatbuffer				(Na2CO3): 0,5M, pH 9,0. Los 4,2 g NaHCO3 op in 80 mL steriel water en pas pH aan tot 9,0 met 10 N NaOH; breng volume op tot 100 mL met steriel water. Om een 50 mM oplossing voor de kleurstof koppelingsreactie te maken, verdun 1:10 met water.Opmerking: Carbonaat buffer verandert van samenstelling na verloop van tijd; maak het elke paar weken tot een maand vers.