Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

Summary

In deze video en aanvullende materialen, tonen we een protocol voor chronische In vivo Beeldvorming van de intacte hersenen met behulp van een verdunde-schedel voorbereiding.

Abstract

In vivo beeldvorming met behulp van twee-foton laser scanning microscopie (2PLSM) maakt de studie van levende cellen en neuronale processen in de intacte hersenen. De techniek hier gepresenteerde maakt de beeldvorming van hetzelfde gebied van de hersenen op verschillende tijdstippen (chronische imaging) met microscopische resolutie waardoor het volgen van dendritische spines die de kleine structuren die de meerderheid van de postsynaptische prikkelende locaties in het CZS te vertegenwoordigen. Het vermogen om helder fijne corticale structuren op te lossen via verschillende tijdstippen heeft vele voordelen, met name in de studie van de hersenen plasticiteit waarin morfologische veranderingen in synapsen en circuit remodelleren kan helpen verklaren onderliggende mechanismen. In deze video-en aanvullend materiaal, tonen we een protocol voor chronische in vivo beeldvorming van de intacte hersenen met behulp van een verdunde-schedel voorbereiding. De verdunde-schedel preparaat is een minimaal invasieve benadering, die potentiële schade aan de dura en / of cortex voorkomt, waardoor het begin van een ontstekingsreactie. Wanneer dit protocol correct wordt uitgevoerd, is het mogelijk om duidelijk de evolutie in de dendritische wervelkolom kenmerken in de intacte hersenen gedurende een langere periode van tijd.

Protocol

1. Te visualiseren neuronen in de intacte hersenen met behulp van twee-foton microscopie, een voorbereiding waar de neuronen worden gelabeld met een fluorescerende merkers wordt gebruikt. In de experimenten die hier gebruiken we de GFP-M transgene muis lijn die labels laag 5 piramidale cellen ^1. Laag 5 piramidale cellen project dendritische processen in oppervlakkige lagen, waardoor de visualisatie van dendrieten en dendritische spines tot een diepte van 300 micrometer onder het niveau van de pia. Een alternatieve aanpak is om het etiket cellen met behulp van virale markers (zie Lowery et al.. Voorgelegd aan Jupiter).
2. Steriliseer de werkruimte met behulp v....

Discussion

Chronische beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie is een steeds populairder techniek om morfologische veranderingen ten gevolge gedurende plasticiteit ^2-5 te bestuderen. Hier laten we zien een verdunde-schedel voorbereiding om de geconstateerde dendritische spines in de intacte hersenen van muizen te volgen op verschillende beeldvormende dag. In dit protocol is de schedel intact gelaten, waardoor minimale schade aan de cortex en resulteert in een zeer lage niveaus van ontstekingsprocessen die kunn.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Medetomindine Hydrochloride		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Midazolam HCL		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribrom–thanol				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 Temp. Control System for Mice		CWE, Inc.	TC-1000 Mouse	Body Temp. Regulation
Toberadex		In House		Eye Ointment
10% Ferric Chloride		Ricca Chemical Company	3120-32	Thin-skull preparation
Microsurgical Blade		Sable Industries	S-6400	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 404,401		Loctite	P/N 46551	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 401		Loctite	P/N 40140	Thin-skull preparation
Zip Kicker Glue Accelerator		Pacer Technology	PT-29	Thin-skull preparation
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter		Fine Science Tools	19008-07	Thin-skull preparation
Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece		Ram Products, Inc.	TECH2000ON/OFF	Thin-skull preparation
#6-0 (0.7 metric ) silk suture		Ethicon Inc.	K8894H	Taper C-1
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved	Surgical Tools	Fine Science Tools	11152-10
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm	Surgical Tools	Fine Science Tools	14084-08
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	Surgical Tools	Fine Science Tools	11000-12