Om genexpressie te onderzoeken in het popstadium vleugel weefsel van Bicyclus anynana, presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor in-situ hybridisaties met behulp van riboprobes. We bieden ook richtlijnen voor de verdere optimalisatie van dit protocol voor het gebruik in popstadium vleugels van andere lepidoptera soorten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In situ Protocol voor Butterfly Wings popstadium gebruik riboprobes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier presenteren wij, in video-formaat, een protocol voor het in situ hybridisaties in popstadium vleugels van de vlinder Bicyclus anynana met behulp van riboprobes. In situ hybridisaties, een steunpilaar van de ontwikkelingsbiologie, zijn nuttig om de ruimtelijke en temporele patronen van genexpressie studie in de ontwikkeling van weefsels op het niveau van transcriptie. Als antilichamen die het eiwit producten van gentranscriptie doelgroep zijn nog niet ontwikkeld en / of er meerdere genen exemplaren van een bepaald eiwit in het genoom die niet kan worden gedifferentieerd gebruik van beschikbare antilichamen, kan in situs plaats daarvan worden gebruikt. Terwijl de een in-situ techniek voor de larven vleugel disks beschikbaar is geweest voor de vlinder community voor meerdere jaren, heeft het huidige protocol is geoptimaliseerd voor de grotere en meer kwetsbare popstadium vleugels.
Protocol
DAG 1
- Bereid de volgende oplossingen:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- DDH 2 O
- Voeg DEPC voor 0,1% van het totaal volume en krachtig schudden oplossingen.
- Autoclaaf.
- 4% Paraformaldehyde Fix - met behulp van PBS-DEPC
- Proteinase K oplossing - als neerslag aanwezig is, vortex krachtig voordat u aliquot
- Spijsvertering Stop Buffer
- Prehybridisatie Buffer
- 50:50 PBT: prehybridisatie Buffer
- Hybridisatiebuffer
- Oplossingen moeten worden gehouden RNase-vrij. Gebruik een glas-ware dat is gebakken (4 uur bij 250 ° C) of wegwerp plastic. Serologisch pipetten zijn zeer nuttig voor het maken van up oplossingen
- Ontleden vleugels van tijd-geënsceneerd poppen in PBS
- Direct naar vleugels Buffer Fix in putjes van 24 en cultuur plaat bij kamertemperatuur
- Fix schijven voor 2 uur
- Was 5 x 5 minuten in PBT
- Incubeer vleugels gedurende 3 minuten in proteïnase K-oplossing
- Spoel 2 x in spijsvertering Stop Buffer
- Was 5 x 5 minuten in PBT
- Was 2 x 5 minuten in 50:50 PBT: PHB
- Was 1 x 10 minuten in de PHB
- Incubeer in PHB minstens 1 uur bij 55 ° C.
- Warmte-denatureren RNA probe (20-50ng nodig per well) (80 ° C gedurende 5 minuten) en toe te voegen aan hybridisatiebuffer (100 ul nodig per well)
- Voeg sonde naar putten en incubeer 48 uur bij 55 ° C
DAG 3
- Was 4 x 5 minuten in 55 ° C PHB
- Incubeer overnacht in PHB bij 55 ° C
DAG 4
- Bereid de volgende oplossingen:
- Antilichaam Block Buffer
- Was een x 5 minuten in 50:50 PBT: PHB
- Was 4 x 5 minuten in PBT
- Incubeer vleugels voor een uur in Block buffer bij 4 ° C
- Incubeer vleugels in een 1:2000 verdunning van anti-Dig antilichaam overnacht bij 4 ° C
DAG 5
- Bereid volgende oplossingen:
- Detectie Buffer
- Het ontwikkelen van Solution - gevoelig voor licht (wikkel in folie)
- Was 3 x 5 minuten in PBT bij kamertemperatuur
- Was 7 x 5 minuten in PBT
- Spoel vleugels twee keer in Detection Buffer
- De ontwikkeling van vleugels in 1 ml van de ontwikkelingslanden Oplossing - tijd van ontwikkeling moet worden gecontroleerd iedere keer - het ontwikkelen van tijden kan veranderen, zelfs bij gebruik van dezelfde sondes en het ontwikkelen van oplossingen - over het algemeen check na 5-10 minuten en vervolgens te verhogen intervallen tot 's nachts. Plaat moet worden verpakt in folie aan het licht blootstelling te voorkomen wanneer het niet controleren van monsters.
- Spoel vijf keer in ontwikkelingslanden Stop Buffer
- Mount vleugels.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Optimalisatie van bestaande protocollen
In situ hybridizaties op larvale vleugel schijven zijn met succes uitgevoerd met behulp van schijven van Precis coenia vlinders (Carroll et al., 1994;. Keys et al. 1999;. Weatherbee et al. 1999.). Het huidige protocol is een aangepaste versie van een schriftelijk en gedetailleerd protocol beschikbaar op verzoek van de Carroll Lab de larven vleugel kleuringen. De veranderingen die we dienen om de verschillen tussen larvale en popstadium vleugel weefsels tegemoet te komen. Tijdens pupal hindwing...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Wij danken Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche technische ondersteuning voor hulp bij het oplossen van dit protocol. We danken ook William Piel voor advies over het bewerken van de film.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Fixatiebuffer | 4% paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0,1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K-oplossing | 2,5mg/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestie-stopbuffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-hybridisatiebuffer | Voor 50 ml PHB: 12 ml DEPC-behandeld water + 25 ml formamide + 12,5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml zalmsperm (Rnase-vrij, hitte-gedenatureerd vóór toevoeging aan de oplossing). | |||
| Hybridisatiebuffer | Voeg 1 mg/ml glycogeen toe aan de pre-hybridisatiebuffer | |||
| Blokkeringsbuffer | 50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | GECONJUGEERD aan alkalische fosfatase |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | C0612 | Monteermedium |
Referenties
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
