Productie van biologisch verkregen Injecteerbare Materialen voor myocard Tissue Engineering

Samenvatting

Werkwijzen voor het bereiden een injecteerbare gel matrix van gedecellulariseerde weefsel en het injecteren van het in rat myocardium In vivo Beschreven.

Samenvatting

Dit protocol biedt methoden voor de bereiding van een injecteerbare extracellulaire matrix (ECM) gel voor myocard tissue engineering toepassingen. In het kort, is gedecellulariseerde weefsel gevriesdroogde, gemalen, enzymatisch verteerd, en vervolgens naar fysiologische pH. Het vriesdrogen verwijdert alle water uit het weefsel, wat resulteert in droge ECM die kunnen tot een fijn poeder gemalen worden met een kleine molen. Na het malen wordt het ECM poeder verteerd met pepsine om een ​​injecteerbare matrix vormen. Na correctie tot pH 7,4, kan het vloeibare matrix-materiaal worden geïnjecteerd in het myocard. Resultaten van eerdere karakterisering assays hebben aangetoond dat matrix gels uit gedecellulariseerde pericardiale en myocardweefsel inheemse ECM componenten, waaronder diverse eiwitten, peptiden en glycosaminoglycanen te behouden. Gezien het gebruik van dit materiaal voor tissue engineering, in vivo karakterisering is vooral nuttig, hier, een methode voor het uitvoeren van een intramurale injectie in de linker ventrikel (LV) vrije wand wordt gepresenteerd als een middel om het analyseren van de gastheer respons op de matrix gel in een klein diermodel. De toegang tot de borstholte wordt verkregen door het diafragma en de injectie wordt gemaakt iets boven de apex in de LV vrije wand. De biologisch verkregen steiger kan worden gevisualiseerd door biotine-labeling vóór de injectie en vervolgens kleuren van het weefsel secties met een mierikswortel peroxidase-geconjugeerde neutravidin en visualiseren via diaminobenzidine (DAB) kleuring. Analyse van de injectie regio kan ook worden gedaan met histologische en immunohistochemische kleuring. Op deze manier werden de eerder onderzochte pericardiale en myocard matrix gels aangetoond dat vezelig, poreuze netwerken te vormen en bloedvatvorming te bevorderen binnen de injectie regio.

Protocol

1. Pre-processing Tissue Voorbereiding

1. Voor het gebruik van dit protocol, moet men al gedecellulariseerde het weefsel van de keuze. Voor dit voorbeeld, zijn vers varkens-en menselijke hartzakje monsters gedecellulariseerde met behulp van hypotoon en hypertoon spoelingen in gedeïoniseerd (DI) water en natriumdodecylsulfaat (SDS).
2. In het bijzonder, eerst de varkens pericard wassen in DI water gedurende 30 minuten, vervolgens continu roer er 1% SDS in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor 24 uur, gevolgd door een vijf uur DI-water te spoelen. Voor menselijke pericardia, eerst afspoelen in DI water gedurende 30 minuten en roer er dan continu in 1% SDS in PBS gedurende 60 tot 65 uur, gevolgd door een 's nachts DI spoelen. Verwijder alle exemplaren van hun definitieve oplossing en spoel opnieuw onder stromend water DI ^1.
3. Om te controleren decellularisatie, een klein stukje te verwijderen, verse bevriezen in OCT bevriezen medium, en neem 10 urn weefselcoupes elke 100 micrometer in het monster voor onderzoek via histologisch onderzoek, zoals eerder gerapporteerd ^34-36.
4. Gebruik hematoxyline en eosine (H & E) vlekken op het weefsel te onderzoeken voor de afwezigheid van kernen. Men kan ook gebruik maken van een fluorescerende Hoescht 33.342 vlek (1.0 ng / mL) voor DNA van de H & E resultaten te verifiëren, kort, bevestig de secties, te hydrateren en spoel in het water, vlekken gedurende 10 minuten, en daarna goed afspoelen en op te slaan in het donker. Als alternatief kan men gebruik maken van een kit, zoals de Qiagen DNeasy bloed en weefsel kit, die is ontworpen om het totale DNA-gehalte van een monster te kwantificeren.

2. Bereiding van injecteerbare ECM

1. Vriesdrogen
   1. Na een geschikte voorbehandeling, bevriezing van de gedecellulariseerde monsters met vloeibare stikstof of op te slaan bij -80 ° C. Lyophilize de monsters tot het volledig droog is. Afhankelijk van uw systeem en het watergehalte van uw monsters, kan dit variëren van 12 tot 72 uur.
2. Frezen
   1. Eens volledig droog is, is een Wiley Mini Mill gebruikt om de droge ECM vermalen tot een fijn poeder. Kies de juiste afmeting van de zeef voor uw doeleinden, hier, de 40 meter gaas wordt gebruikt. Zodra de meerderheid van het monster is gekomen door het filter, verwijdert u de collectie pot met de gefreesde ECM poeder. Als er slechts een kleine steekproef, kan de rest van het monster worden geëxtraheerd uit de molen in een verschillende manieren, hier, een Q-tip wordt gebruikt om de ECM vast te zitten achter de stilstaande wieken van de molen te verwijderen.
   2. Zorg er altijd voor dat de molen is schoon en vrij van vuil. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat zowel de molen en uw monster helemaal droog zijn, het resterende vocht zal de ECM te aggregeren en samenklonteren veroorzaken, het voorkomen van een succesvolle frezen. De ECM kan halen vocht uit de lucht en dus moet direct gaan van de vriesdroger naar de molen.
3. Spijsvertering
   1. Het vormen van de injecteerbare ECM, is het poeder verteerd pepsine. Het volgende protocol werd gewijzigd van Freyetes, et al. (2)..
   2. Het is belangrijk om zo steriel een product als mogelijk, als het wordt ingespoten in vivo en vervuiling kan leiden tot complicaties. Dus, gebruik steriele flacons en wegen lepels en filter alle oplossingen voor gebruik. Een vriesdrogen stap na het frezen en voor de spijsvertering zal ook helpen handhaven van de steriele.
   3. Weeg de gewenste hoeveelheid van ECM poeder in een geschikte scintillatieflesje. Voor de totale volumes kleiner dan 1 ml, is het raadzaam u een 2 ml flacon en voor grotere volumes, een 20 ml flesje. Dit zorgt ervoor dat er voldoende vloeistof in de bodem van de flacon om effectief te roeren.
   4. Weeg de gewenste hoeveelheid pepsine in een scintillatieflesje. Voeg 0,1 M HCl zodanig dat de pepsine is in een concentratie van 1 mg / ml. Zorg ervoor dat de pepsine volledig is opgelost (geen deeltjes) voordat deze kan worden versneld door vortexen de pepsine-oplossing.
   5. Voeg de pepsine / HCl-oplossing voor de scintillatieflesje met de ECM-poeder, zodat de ECM is een concentratie van 10 mg / ml.
   6. Roer voortdurend oplossing voor 60-65 uur, periodiek schrapen langs de zijkanten van de flacon met een gewicht lepel of spatel.
4. pH-regeling
   1. Deze stap wordt uitgevoerd om het vloeibare matrixmateriaal te brengen fysiologische pH en de pepsine te inactiveren, waardoor het van het splitsen van het ECM verder. Nogmaals, moet u gefilterd oplossingen gemaakt met Millipore water te gebruiken.
   2. 1 M NaOH wordt toegevoegd aan zijn 1 / 10 het oorspronkelijke volume. Test de pH-waarde op dit punt en voeg kleine hoeveelheden (2-10 ul) NaOH of HCl zodanig dat de gewenste pH (7,4) is bereikt. Blijf op de hoogte van alle kleine hoeveelheden toegevoegd voor de neutralisatie of verwijderd voor de pH-testen. Zodra de oplossing is geneutraliseerd, voeg 10x PBS vastgesteld op 1 / 10 van de uiteindelijke volume (1 / 9 van de huidige volume). Bepaal de concentratie van de injecteerbare ECM en voeg vervolgens 1x PBS om de gewenste finale samenwerking te bereikenncentration, hier 6 mg / ml.
   3. Karakterisering van de injecteerbare ECM kan via SDS-PAGE, Blyscan colorimetrisch GAG Assay, en massa spectroscopie.
   4. Op dit punt kan de matrix materiaal worden geïnjecteerd in vivo een steiger voor het myocard tissue engineering vormen.
5. Biotine-Etikettering
   1. De ECM kan worden gelabeld met biotine vóór de injectie voor eenvoudige visualisatie van het geïnjecteerde ECM.
   2. Bereid een 10 mM oplossing van biotine en toe te voegen aan de injecteerbare ECM in een verhouding van 0.3mg/mg. De ECM moet op de gewenste concentratie voor injectie. Als het injecteren bij een concentratie van 6 mg / ml, voeg 40 ul biotine per 1 mL van ECM. Voorafgaand aan de injectie, houdt u de biotine-ECM-oplossing op ijs gedurende ten minste 1 uur.
6. Alle stappen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Om te voorkomen dat de injecteerbare matrix van geleiachtige, kan de aanpassing van de pH stap worden gedaan op het ijs.

3. Myocardiale Injecties

1. Injectie voorbereiding
   1. Voor de vrouwelijke ratten (225-250 g) hier gebruikte, werden 75 pi injecties van pH 7,4 injecteerbare ECM opgesteld in 0,1 ml spuiten getipt met 30 gauge naalden. Als mannelijke ratten (375-400 g) werden gebruikt, kon 90 pi worden geïnjecteerd.
   2. Alle chirurgische benodigdheden moeten voorafgaand aan de operatie gesteriliseerd worden, hier gebruiken we een geautoclaveerd chirurgische pakket dat alle noodzakelijke tools bevat.
2. Op de dag van de operatie, een Harlan Sprague-Dawley rat is verdoofd met behulp van isofluraan op 5%, geïntubeerd met behulp van een otoscoop, en dan gehandhaafd op 2,5% isofluraan tijdens de gehele procedure.
3. Voeg kunsttranen zalf voor de ogen van het dier te beschermen tegen droogte en haar. Dien 3 ml van lactaat Ringers oplossing voor hydratatie tijdens de operatie. Dit dient te gebeuren via subcutane injectie in de onderbuik.
4. Plaats het dier in rugligging op de chirurgische tafel en zacht band naar beneden ledematen. Gebruik klippers om het haar te verwijderen op de buik en vacuüm vrij haar voorafgaand aan schrobben.
5. Maak een serie kleine injecties (ongeveer 50 pi elk) van 2% lidocaïne langs een diagonaal van het zyphoid proces om de onderste rechterkant van de buik. Daarna schrobben drie keer met betadine, te beginnen in het midden en bewegen naar buiten. Herhaal dit met 70% ethanol. Bedek het dier met behulp van een chirurgische draperen met een pre-made ronde venster, veilig met handdoek klemmen, indien nodig.
6. Met behulp van een scalpel nr. 10 een 3-4 cm incisie van de xyphoid proces om de onderste rechterkant van de buik. Zoek xyphoid proces en verticaal naar beneden door de spier ontleden naar rechts, let daarbij goed op het grote schip aan de rechterkant te voorkomen. Als je eenmaal hebt ontleed door de spier, gebruik van schaar om zijwaarts dwars door de spier, waardoor de membraan. Wees voorzichtig om de lever te voorkomen.
7. Met behulp van een 36 inch lengte van 3-0 Vicrile hechtingen en een paar hemostats, rijdt een naald door de zyphoid proces en trek de hechtdraad halverwege. Plak de uiteinden van de hechtdraad bij elkaar en bevestig dat aan een punt boven en achter het dier in wezen het opheffen van de zyphoid omhoog en het blootstellen van de membraan. Met een andere 36 inch lengte van 3-0 Vicrile hechtdraad, rijdt een naald door de spieren het dichtst bij de xyphoid proces en, nogmaals, haal deze door en de uiteinden vast aan een ander punt aan de rechterkant van de chirurgische tafel, volledig blootleggen van de chirurgische holte.
8. Op dit punt, moet u in staat om het hart te zien door het middenrif. Met behulp van een klein paar van de rat tand microforceps, pak het centrum van diafragma, trek deze naar u toe en maken een zeer kleine incisie met stompe schaar. Het is uiterst belangrijk tot zeer botte schaar te gebruiken om te voorkomen porren de longen. Zodra dit gat is gemaakt, zal de longen trekken, zodat u een 2-3 cm incisie verticaal te maken door het membraan naar het hart zichtbaar te maken.
9. Plaats een 3-inch Q-tip aan de linkerkant van de holte naar de longen duwen uit de weg. Gebruik een handdoek klem om de Q-tip op zijn plaats veilig te stellen. Gebruik een andere Q-tip voor de rechter long te verplaatsen uit de weg om de hartzak vinden. Met behulp van een paar microforceps en een paar grote gekartelde forceps, scheur door de hartzak, waardoor de top van het hart. Als het dier al eerder ondergaan een infarct procedure, zal het hartzakje al afwezig.
10. Pak de top van het hart met de rat tand microforceps en injecteer de vloeistof matrixmateriaal een derde van de weg uit de top. Steek de naald parallel aan het oppervlak en epicardiale injecteren met de schuine rand van de naald naar links. Zorg ervoor dat de grote hart vene te vermijden. Wacht een paar seconden voordat u de naald. Ziet u een whitening van het weefsel op de plaats van injectie.
11. Opruimen bloed in de holte en verwijder de handdoek klem en Q-tip, dat hield de rechter long. Gebruik gebogen microhemostats en de rattand microforceps te sluiten het middenrif. Een eerste knoop en gebruik vervolgens de gekartelde tang en microhemostats om het diafragma te sluiten met een doorlopende hechting en een taps toelopende naald. Vóór het sluiten van volledig, plaatst PE160 zuig slang en gebruik een 10 ml spuit om de borstholte te evacueren als de hechting is aangescherpt.
12. Wanneer behoorlijk ontruimd en gesloten, moet het membraan worden concave. Een convexe diafragma geeft aan dat er nog lucht in de holte.
13. Op dit punt is de isofluraan kan worden gedraaid tot 1%.
14. Haal de beide 3-0 Vicrile hechtingen die de holte te openen. Gebruik steriel water te hydrateren de spier, vegen overtollige weg met een Q-tip of een steriel gaasje. Gebruik een nieuwe lengte van 3-0 hechtdraad tot de spierlaag te sluiten met intermitterende hechtingen.
15. Op dit punt kan de isofluraan worden uitgeschakeld.
16. Schoon met een steriel water en gebruik nietjes aan de huid te sluiten. Indien u krammen zal interfereren met de studie, kan 5-0 proline hechtingen ook worden gebruikt. In dat geval gebruikt een omgekeerde snijden (RC) naald om de huid te sluiten met intermitterende hechtingen. In beide gevallen, spot chirurgische lijm over de gesloten incisie.
17. Gebruik een wattenstaafje om de incisie zalven met een triple-antibiotische zalf.
18. Laat het dier te laten bekomen onder de 100% zuurstof.
19. Toen de dieren begint te ademen rond de ventilator, verwijder de luchtpijp buis.
20. Nadat de dieren zijn borstbeen, beheer van een subcutane injectie van 0,05 mg / kg van buprenorfine-hydrochloride en breng ze terug naar hun huis kooi op een steriele handdoek.
21. De dieren moeten ontvangen post-operatieve observatie en zorg.
22. Op het moment punten van belang, worden de dieren gedood en de harten verwijderd voor analyse. Korte as doorsneden worden genomen en kunnen worden gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E) voor grove weefsel analyse. Op korte tijd punten, zal het geïnjecteerde gebied verschijnen als een roze, vezelig netwerk dat interstitially heeft verspreid. Op latere tijdstippen, zal men zien een instroom van cellen en een eventuele degradatie van de geïnjecteerde matrix na 2 tot 3 weken. Als de ECM was gelabeld met biotine alvorens te injecteren, kan het meer direct gevisualiseerd door kleuring van de biotine met HRP-geconjugeerd streptavidine. Immunohistochemische kleuring kan gebruikt worden om specifieke cellen of structuren in de injectie regio te identificeren, hier de dia's zijn co-gekleurd met een FITC-geconjugeerd isolectin dat aan endotheelcellen en licht groen en een anti-gladde spier actine antilichaam bindt met een Alexafluor secundaire antilichaam dat de SMC in het rood rapporten.

4. Representatieve resultaten

Vorige karakterisering van matrixmaterialen op deze wijze voorbereid toonde het behoud van een groot aantal macromoleculen. In het bijzonder, werden meerdere vezelachtige eiwitten en glycoproteïnen geïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie (tabel 1). Als de matrix materialen verwerkt in overeenstemming met dit protocol worden gevonden om niet langer bevatten een complex scala van macromoleculen, kan het zijn dat de gebruikte decellularisatie protocol is te hard. Eenmaal volledig gevriesdroogde, de gedroogde pericardiale ECM ziet eruit als een zeer stijve, verfrommeld papier. Andere weefseltypen zal lijken op verpakking pinda's. Indien goed gefreesd, moet de ECM vallen door de zeef en worden verzameld in de pot aan de onderkant. Als er vocht meer in de steekproef, de ECM zullen samenklonteren en blijven steken in het frezen kamer. Na de vertering, moet de ECM-oplossing een melkachtige kleur en volledig vrij van zichtbare deeltjes. Het zal ook iets meer dan de viskeuze HCl alleen. Als de ECM niet goed verteren, zal er nog steeds grote deeltjes in de flacon, als alternatief, de ECM kan uit crash van oplossing. Na de pH-aanpassing, is er geen zichtbare verandering in de oplossing, en de ECM is nog steeds een troebel, homogene vloeistof. Als het begint te gel, zal de viscositeit toenemen en zal het moeilijk of onmogelijk om het materiaal te stellen in een spuit. Als dit gebeurt, voert u de aanpassing van de pH stap op het ijs, met pre-gekoelde oplossingen. Zodra de injecties zijn voorbereid, houd ze op ijs tot gebruik. Als de injectie is succesvol, de regio rond de naald bleekt en een kleine bolus zichtbaar is. Als dit niet wordt nageleefd, kan de injectie zijn gegaan in de kamer in plaats van in de muur. Tijdens het hechten het dier na injectie, een zorgvuldige afsluiting van het middenrif is de belangrijkste stap. Als dit juist gebeurt, zal het membraan worden strak tegen de longen en het zal verschijnen concave. Als er een lucht meer in de longen, zal het membraan blijven convex, of hebben een gebied waar het ballonnen uit. Bij het onderzoek van de histologie van de injectie regio in een vroeg tijdstip (30 minuten tot 4 uur na de injectie), moet men zien een roze, vezelig gebied dat verstoken is van cellen is dit het weer in elkaar gezet matrixmateriaal post-injectie (figuur 2) . Het netwerk verspreidt zich vaak interstitially en kan aanwezig zijn in heel veel delen. Een possbaar verklaring voor het zien van slechts een zeer klein gebied van matrix gel is dat een deel van de injectie de intramurale doel gemist en werd ofwel geïnjecteerd in de LV kamer of gelekt uit de injectie plaats. Bovendien, afhankelijk van de gelering tijd kan de interstitiële verspreiden variëren.

Figuur 1. Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) resultaten. (A) Molecuulgewicht standaard. (B) Rat staart collageen type I (2,5 mg / ml) vergeleken met het opgeloste menselijke (C) en varkens (D) pericardiale ECM (7 mg / ml). Let op de aanwezigheid van collageen evenals verscheidene andere eiwitten en peptiden in de pericardiale matrix monsters.

Tabel 1. ECM componenten geïdentificeerd met massa-spectroscopie.

Figuur 2 Myocardiale injecties:. Gelering in vivo. H & E kleuring van de mens (A) en varkens (B) pericardiale matrix injecties die in vivo gegeleerde na 45 minuten. Pijlen duiden matrix locatie, gekleurd lichter roze dan het myocard. Schaal bar is 500 micrometer.

Figuur 3. Vasculaire cel infiltratie. Fluorescerende vlekken voor schepen in de geïnjecteerde mens (AC) en varkens (DF) matrix gels op twee weken. Endotheelcellen zijn gelabeld groen (A, D), terwijl gladde spiercellen zijn gelabeld rood (B, E). Samengevoegde beelden worden getoond in C en F. Schaal bar is 100 micrometer. De witte stippellijnen geven het gebied van matrix injectie, zoals bepaald door H & E analyse van een nabijgelegen sectie.

Figuur 4. Stamcellen binnen matrix injectie regio. Een Hoescht vlek voor de kernen (blauw) en c-kit (groen) identificeert stamcellen in het menselijk (A) en varkens (B) matrix injectie regio's. Schaal bar is 50 micrometer.

Discussie

Deze methode maakt het mogelijk voor de productie van biologisch verkregen, injecteerbare steigers voor myocardiale tissue engineering. Hoewel deze methoden werden in eerste instantie ontwikkeld voor de fabricage en in vivo testen van een myocard-matrix gel en hier gepresenteerd met een pericardiale matrix gel, dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met elk weefsel, op voorwaarde dat het weefsel juiste manier kan worden gedecellulariseerde. Decellularisatie dient te worden uitgevoerd en voorafgaand aan ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia:
Pepsin	Sigma-Aldrich	p6887-1G	Gelyofiliseerd
Biotine	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
Neutravidin-HRP	Thomas Scientific	21130
Apparatuur:
Wiley Mini Mill	Thomas Scientific	3383L10
Labconco Lyofilisator	Labconco Corp.	7670520
Chirurgische benodigdheden:
Betadine	Purdue Products L.P.	67618-154-16
Lactated Ringers-oplossing	MWI Veterinary Supply	003966
KY Jelly	MWI Veterinary Supply	28658
Lidocaïne, 2%	MWI Veterinary Supply	17767
Buprenorfinehydrochloride	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Kunsttranenzalf	Fisher Scientific	NC9860843
Triple antibioticazalf	Fisher Scientific	19082795
Isofluraan	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
Otoscoop	MWI Veterinary Supply	008699
Stopkraan	MWI Veterinary Supply	006245
3-0 Vicryl-hechtdraad	MWI Veterinary Supply	J327H
5-0 Prolene-hechtdraad	MWI Veterinary Supply	s-1173
Reverse cutting (RC) naald	Ethicon Inc.	8684G
Microhemostat	Fine Science Tools	13013-14
Ratten-tand micro-pincet	Fine Science Tools	11084-07
Nr. 10 scalpel	Fine Science Tools	10110-01
Bottsnijderschaar	Fine Science Tools	14108-09
Scherpe, gebogen schaar	Fine Science Tools	14085-08
Grote, gekartelde pincet	Fine Science Tools	1106-12
PE160 zuigslang	BD Biosciences	427430
Trimmer	MWI Veterinary Supply	21608
Huidnietjes/nietapparaat	Ethicon Inc.	PRR35
Algemene benodigdheden:
Roerplaten
0.1 M HCl
1 M NaOH
10x PBS
1x PBS
70% Ethanol
0.1 mL spuiten
10 mL spuit
Wattenstaafjes
Chirurgische lijm
Chirurgisch afdekdoek
Handdoekklemmen
Kleine handheld vacuümpomp