Studie gliale cel Heterogeniteit Invloed op Axon groei met een nieuwe methode Coculture

Samenvatting

In dit protocol beschrijven we een nieuwe methode om de invloed van de gliale cel heterogeniteit op axongroei studie met een In vitro Co-cultuur systeem. Rat corticale gliale cellen werden gekweekt tot confluentie en cocultured met zeer zuivere rat achterwortelganglia neuronen. Verschillende gliale cel invloed op de neuronen hechting en axongroei werd direct vergeleken in dezelfde cultuur. Deze methode biedt een nieuwe manier om direct de studie van de gliale cel heterogeniteit invloed op de hechting en neuron axon groei.

Samenvatting

In het centrale zenuwstelsel van alle zoogdieren, afgesneden axonen na verwonding niet in staat zijn te regenereren in hun oorspronkelijke doelen en functioneel herstel is zeer slecht ^1. Het falen van regeneratie van axonen is een gecombineerde resultaat van verschillende factoren, waaronder de vijandige gliale cel omgeving, remmende myeline verwante moleculen en een verminderde intrinsieke neuron regeneratievermogen ^2. Astrocyten zijn de meest overheersende gliale celtype in het centrale zenuwstelsel en spelen een belangrijke rol in het axon taken uit hoofde van fysiologie en pathologie voorwaarden ^3. Tegenstelling tot de homologe oligodendrocyten, astrocyten zijn een heterogene celpopulatie samengesteld door verschillende astrocyten subpopulaties met verschillende morfologie en gen-expressie ^4. De functionele betekenis van deze heterogeniteit, zoals hun invloeden op axon groei, is grotendeels onbekend.

De studie van de gliale cel, in het bijzonder de functie van astrocyte heterogeniteit in het gedrag van neuron, hebben we een nieuwe methode door de co-kweken van hoog gezuiverde achterwortelganglia neuronen met gliacellen verkregen uit de rat cortex. Door deze techniek konden we neuron hechting en axongroei direct vergelijken op verschillende subpopulaties astrocyten onder dezelfde voorwaarde.

In dit rapport geven we de gedetailleerde protocol van deze methode voor astrocyten isolatie en cultuur, achterwortelganglia neuronen isolatie en zuivering, en de co-cultuur van de DRG neuronen met astrocyten. Deze methode kan ook worden uitgebreid tot andere gebieden van de hersenen om de cellulaire of regionaal specifieke interactie tussen neuronen en gliacellen te bestuderen.

Protocol

1. Glia Cel Cultuur

Gliale cellen kunnen worden gekweekt uit verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel. Het hele proces is weergegeven in figuur proces.

Dag 1 Coating cultuur plaat en dekglaasjes

1. Droog gesteriliseerd glas microscoop ronde dekglaasjes in een autoclaaf.
2. Het bord van de gesteriliseerde dekglaasjes in gesteriliseerde 24-well plaat cultuur.
3. Coat de dekglaasjes met poly-lysine en incubeer gedurende 2 uur onder wortel temperatuur.
4. Coat 6-well platen cultuur op dezelfde manier als in stap 3.
5. Twee keer was de dekglaasjes en 6-well cultuur plaat met gedestilleerd water en de lucht drogen in de cultuur kap.
6. Voeg 200 pi DMEM medium (met 10% FBS) in elk putje in 24-well plaat en 2 ml in elk putje in 6-wells plaat en leg ze in de broedmachine onder 37 graden met 5% CO ₂

Dag 2 isoleren cortex en gliale celculturen

1. Steriliseer de positieve stroom dissectie kap.
2. Schakel UV-licht gedurende 20 minuten.
3. Spray alle oppervlakken met 70% ethanol en wacht 15 minuten voor gebruik.
4. verandering tijd: Verdoof rat pups (P2-P6) door onderkoeling, en onthoofden aan de voet van het framen magnum met behulp van operationele schaar.
5. Open de schedel langs de pijlnaad met behulp van een iris schaar en pel de schedel.
6. Verwijder de voorhersenen en zet ze in gekoelde L15 medium, onder stereomicroscoop, zorgvuldig schoon de dura en de pia membraan met bloedvaten, isoleren van de cortex en was meerdere malen met L15 medium.
7. Snijd de cortex in kleine stukjes met microchirurgie schaar.
8. Voeg 0,125% trypsine-EDTA met L15 bereid medium in de cortex stukken en incubeer bij 37 graden gedurende 15 minuten.
9. Overdracht weefsel blokken in 20 ml DMEM medium met 20% FBS in 50 ml tube, voeg DNase stockoplossing aan uiteindelijke concentratie 10ug/mL, het weefsel oplossing op aspireren en neer voor 20 keer met vuur gepolijst glas Pasteure pipet, het verzamelen van de individuele cellen ophanging.
10. Was de celsuspensie een keer met DMEM-medium, opnieuw te schorten cellen in DMEM met 10% FBS, cellen te tellen onder de microscoop met een hemocytometer, zaad cellen in 5000-10000/cm ^2. Behouden cellen in een 37 graden 5% incubator, veranderen de helft van het medium 2 keer per week.

2. Achterwortelganglia Neuronen Isolatie, Cultuur en zuivering

Dag 1 Maak Cultuur Materiaal

1. De vacht van de gesteriliseerde dekglaasjes met poly-lysine, wassen coverslips tweemaal met gedistilleerd water en lucht drogen, zet ze in 24-well platen.
2. Voeg 100μL Neurobasal medium met 2% B27 en 2.5S NGF (50 ng / ml), zet plaat in 37 graden 5% CO _2.

Dag 2 Isoleer DRG's uit embryo's

1. Gesteriliseerd de stroming kap op dezelfde manier als gliale cel cultuur.
2. Euthanaseren een zwangere rat (E15) door een overdosis met CO _2, gesteriliseerd buik met 70% ethanol, werd geïsoleerd uit embryo's baarmoeder en in gekoelde L15 medium.
3. Isoleer ruggenmerg met de aangesloten achterwortelganglia onder stereomicroscoop en transfer naar 35mm gerechten met gekoelde L15 medium.
4. Verzamel enkele celsuspensie en was een keer met NBF medium (Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50 ng / ml)).

Dag 3 Zuiver DRG neuronen

1. 18u-24u na het neuron zaaien, voeg dan een een mM geconcentreerde FUDR stockoplossing aan het neuron cultuur tot een uiteindelijke concentratie van 20 uM en een uiteindelijk volume van 200 pi.
2. 72h later, vervang dan de helft van de medium met Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50ng/mL) zonder FUDR. Daarna, wijzigt u het medium om de andere dag.

3. Coculture DRG neuronen met gliacellen

1. Wanneer gliale celcultuur samenloop (ongeveer 20 dagen na zaaien) bereikt, waren ze klaar voor coculture met neuronen.
2. 24 uur voor het toevoegen van de gezuiverde neuronen, werden gliacellen medium veranderd in Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50 ng / ml).
3. Gezuiverde neuronen werden verzameld van cultuur putten, waren enkele cellen ophanging verkregen door mechanische passeren vuur gepolijst Pasteure pipet.
4. Na het tellen van het aantal, werden neuronen gezaaid op 500/cm ² op confluent gliale cellen in Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50ng/mL).
5. Neuronen hechting en neurieten groei op gliale cellen kunnen worden opgenomen en geanalyseerd op verschillende tijdstippen door beeldanalyse-software en met behulp van immunocytochemie celtype specifieke antilichamen.

4. Representatieve resultaten

1. Gliale celculturen: Na het zaaien, zal gliacellen worden samenvloeiende ongeveer 20 dagen. Onder fase contrast MicroscOPE, was het gemakkelijk te herkennen dat verschillende morfologische gliale cel subpopulaties ander groeipatroon onderbouw gevormd en de GFAP positieve astrocyten goed voor meer dan 90% zoals blijkt uit immuocytochemisty techniek (figuur 1, figuur 2).
2. DRG neuronen cultuur: In onze methode, na 72 uur FUDR behandeling, de zuiverheid van de DRG neuronen zal zo hoog als 99% te bereiken binnen 6 dagen, DRG neuronen toonden hun unieke morfologie en met een hoge dichtheid van neurieten groei (Figuur 3, Figuur 4).
3. Gliale cellen en neuronen coculture: DRG neuronen hechting en neurietuitgroei zich gemakkelijk op de gliale cellen binnen de 4 uur na het uitzaaien, is een zorgvuldige observaties toonden aan dat neuron hechting en groei van neurieten werden beïnvloed door gliale cel subpopulaties die speciale groeipatroon onderbouw gevormd, kan dit gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd onder fasecontrastmicroscoop en door middel van immunocytochemie (Figuur 5, Figuur 6).

Figuur 1. Morfologie van confluerende gliacellen. Corticale gliale cellen werden uitgeplaat op polylysine gecoate dekglaasje en gekweekt gedurende 20 dagen, de verschillende groeipatroon van gliacellen nota, cellen aan de linkerkant gerangschikt in een uitgestraald manier.

Figuur 2. Confluente gliacellen gelabeld door gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) antilichaam. Let op de uitgestraalde opstelling van GFAP (rood) positieve cellen aan de rechterkant.

Figuur 3. Achterwortelganglia neuronen groeide in vitro zonder FUDR behandeling. Contaminerende cellen gevormd neuronen 'achtergrond DRG.

Figuur 4. Achterwortelganglia neuronen groeide in vitro na FUDR behandeling. De achtergrond contaminerende cellen was volledig geëlimineerd.

Figuur 5. Achterwortelganglia neuronen gekweekt op gliacellen. Neuronen hechting en neurieten groei werd geremd op de uitgestraalde geregeld cellen en beperkt aan de rechterkant gliacellen.

Figuur 6. Achterwortelganglia neuronen groeien op gliale cellen gelabeld door neurofilament antilichaam. De neurieten (groen) geremd op de uitgestraalde geregeld linkerkant gliacellen en beperkt aan de rechterkant, werden alle gliale cellen gelabeld door GFAP antilichaam (rood).

Discussie

Dit experiment protocol is ontworpen om twee doelen te bereiken gliacellen, in het bijzonder astrocyten heterogeniteit van invloed op de neuron hechting en neurieten groei te bestuderen. Het eerste doel was om astrocyten heterogeniteit zoveel mogelijk, in dit experiment te houden, was de samenvloeiing gliale cel cultuur verrijkt astrocyten gemengde primaire cultuur zonder enige chemische behandeling en de spijsvertering voortplanting, die verder kan schade aan de cel en veroorzaken letsel reactie van astrocyten. De laat...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM(hoog glucose)	Invitrogen	10313-039
L15 medium	Invitrogen	11415-114
FBS	Invitrogen	10437-077
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
poly-lysine	Sigma-Aldrich	P4832	cultuurkwaliteit
NGF(2.5S)	Invitrogen	13257-019
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
0.25% trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503
neurofilament antilichaam	Abcam	ab24575