Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo's

Summary

Beschrijven we de procedure voor te bereiden geënsceneerde Drosophila Embryo's voor de visualisatie van de embryonale zenuwstelsel tijdens de embryogenese.

Abstract

De Drosophila embryo is een aantrekkelijk model voor onderzoek naar de cellulaire en moleculaire basis van neuronale ontwikkeling. Hier beschrijven we de procedure voor de visualisatie van Drosophila embryonale zenuwstelsel met behulp van antilichamen tegen neuronale eiwitten. Omdat de hele embryonale perifere zenuwstelsel en het centrale zenuwstelsel zijn goed gekarakteriseerd op het niveau van individuele cellen (Dambly-Chaudière et al., 1986;.. Bodmer et al., 1987;. Bodmer et al., 1989), eventuele afwijkingen aan deze systemen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd met behulp van antilichamen tegen verschillende neuronale eiwitten. De zich ontwikkelende embryo's worden verzameld op bepaalde tijden te zorgen dat de embryo's worden in de juiste ontwikkelingsstadia voor visualisatie. Na het verzamelen, worden de buitenste lagen van het embryo, het chorion membraan en de vitelline envelop dat het embryo omgeeft, verwijderd voordat fixatie. Embryo's worden vervolgens geïncubeerd met neuronale antilichamen en gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde secundaire antilichamen. Embryo's in stadia 12 tot 17 worden gevisualiseerd op de embryonale zenuwstelsel toegang. In fase 12 van de CNS kiem band begint verkorten en door etappe 15 de definitieve patroon van de commissuur is bereikt. Per fase 17 van de CNS contracten en de PNS is volledig ontwikkeld (Campos-Ortega et al.. 1985). Zo veranderingen in het patroon van de PNS en CNS kan gemakkelijk worden geobserveerd tijdens deze ontwikkelingsstadia.

Protocol

1. Voorbereiding van de reagentia

1. Bereid de PEMFA Buffer met behulp van 100mm Pipes, 2mm EGTA, en 1 mM MgSO _4. Breng de pH van de buffer tot 7,0. De buffer is PEMFA filter gesteriliseerd en opgeslagen bij 4 ° C.
2. Bereid PBT door het toevoegen van 1 ml van Triton X-100 tot 100 ml 1x PBS (fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing) (pH 7,0). Bewaren bij 4 ° C.
3. Bereid 5% BSA (bovine serum albumine) met 0,01% NaAcide in 1x PBS (pH 7,0).
4. Bereid de zoutoplossing met 0,7% NaCl en 0,03% Triton X-100 in gedeïoniseerd water.
5. Bereid het fixatief door de combinatie van vier onderdelen PEMFA buffer met 1 deel ....

Discussion

De Drosophila embryo is een krachtig systeem voor het onderzoeken van de cellulaire en moleculaire veranderingen tijdens neuronale ontwikkeling. In dit protocol hebben we laten zien hoe je ganse berg embryo's voor te bereiden op immunohistochemie. We hebben aangepast dit protocol bij het protocol beschreven in Carroll en Scott, 1985. Dit protocol kan ook worden aangepast aan andere neuronale antistoffen te testen, maar optimalisatie van antilichamen moet worden gedaan. Verder kunnen defecten in de ontwikkel.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-25
CSP	Developmental Studies Hybridoma Bank
HRP-FITC	Jackson ImmunoResearch	323-095-021
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11004
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000