Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Samenvatting

Dit werk laat zien hoe een RNA / DNA hybride vorm op de chromosomale niveau en onthullen de overdracht van genetische informatie van RNA naar DNA genoom in gistcellen.

Samenvatting

Synthetische korte nucleïnezuur polymeren, oligonucleotiden (oligos), zijn de meest functionele en wijdverbreide instrumenten van de moleculaire biologie. Oligo kunnen geproduceerd worden in elke gewenste DNA-of RNA-sequentie bevatten en kunnen worden bereid om een ​​breed scala aan basis-en suiker wijzigingen omvatten. Bovendien kan oligo worden ontworpen om specifieke nucleïnezuur veranderingen na te bootsen en zo, kan dienen als belangrijke instrumenten om de effecten van DNA-schade en de mechanismen van de reparatie te onderzoeken. We vonden dat de Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo's met een lengte tussen de 50 en 80 nucleotiden kunnen bijzonder geschikt zijn om te studeren, in vivo, functies en gevolgen van chromosomale RNA / DNA hybriden en van ribonucleotiden ingebed in DNA. RNA / DNA hybriden kan gemakkelijk vorm tijdens de DNA-replicatie, reparatie en transcriptie, echter zeer weinig bekend over de stabiliteit van het RNA / DNA hybriden in cellen en in welke mate deze hybriden kan de genetische integriteit van de cellen beïnvloeden. RNA-bevattende oligos, daarom vormen een perfecte vector om ribonucleotiden te introduceren in chromosomaal DNA en het genereren van RNA / DNA hybriden van de gekozen lengte en de basis samenstelling. Hier presenteren wij het ​​protocol voor de integratie van ribonucleotiden in het genoom van de eukaryote modelsysteem gist / Saccharomyces cerevisiae /. Toch heeft ons lab gebruikt Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo's aan RNA / DNA hybriden te genereren op het chromosomaal niveau in verschillende celsystemen, van bacteriën tot menselijke cellen.

Protocol

Motivering

Het benutten van het gebruik van Thermo Scientific Dharmacon oligo's, 50 tot 80-mers, hier presenteren we een procedure, op basis van een gen correctie-test, waarmee oligos kan de genetische informatie over te dragen aan genomisch DNA van gistcellen, na gloeien naar het doel chromosomale DNA. Succesvolle targeting door oligo's wordt gescoord door de verschijning van gist kolonies weergave van het verwachte fenotype. Als de gewenste genetische modificatie wordt uitgevoerd binnen een of meer ribonucleotiden opgenomen in de oligo volgorde, de genetische informatie vloeit rechtstreeks voort uit het RNA-darmkanaal om de chromosomale doel-DNA, dus een RNA / DNA hybride vormen op de chromosomale niveau tijdens de targeting proces. De ribonucleotide / s van een Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo kan dienen als sjabloon voor gen-targeting via DNA-reparatie synthese of kan worden ingebed in het DNA en dienen als template tijdens de replicatie van DNA. In deze experimenten gebruiken we de gist / Saccharomyces cerevisiae / eukaryotische model systeem, maar een dergelijke benadering kan ook worden toegepast in andere organismen of celtypen. In deze video maken we gebruik van een Thermo Scientific Dharmacon oligo ontworpen met homologie met een doel gist genomische locus en die een ribonucleotide in het midden om een ​​mutatie in het target-gen te corrigeren. Na transformatie met de RNA-bevattende oligo, zien we de correctie van de beoogde site op een bepaalde frequentie, wat aangeeft dat de RNA-darmkanaal van de oligo zou kunnen worden opgenomen in het chromosomale DNA en dienen als template voor DNA-synthese tijdens de DNA-replicatie. De genetische informatie uitgevoerd in het RNA-darmkanaal is stabiel doorgegeven aan de volgende cel generaties. Hier beschrijven we de stappen van de gistcel transformatie door de Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo en de aanpak van het RNA-informatie overdracht in het chromosomale DNA te detecteren.

A. Ontwerp van de RNA-bevattende Oligo gebruikt in dit experiment

We hebben een RNA-bevattende oligo aan een genetisch defect in de gist juiste S. cerevisiae chromosomale DNA in de trp5 locus. De gist stam gebruikt in de protocol bevat een mutant trp5 gen met een twee-base verwijderen en een nonsense mutatie (figuur 1A). Dergelijke giststam is een tryptofaan auxotrofe mutant en niet kolonies op media vorm zonder tryptofaan. De DNA-sequentie van de TRP5-gen is te vinden op de Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). De Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo gebruikt in dit protocol is een 65-mer met een 2-base DNA insertie, ontworpen om de verwijdering mutatie en een ribonucleotide ontworpen om de nonsense mutatie van het trp5 allel (Figuur 1A) correct te corrigeren. De volgorde van de oligo is als volgt opgebouwd:
5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Dit oligo wordt gesynthetiseerd door Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) bij 200 nm schaal, en wordt ontzout, ontschermd en gebruikt zonder PAGE zuivering.

B. Bereiding van de RNA-bevattende Oligo voor Gist Transformatie (gemodificeerd van Storici et al.., 2007 ¹⁾

1. Veeg materialen die gebruikt zal worden voor het experiment met inbegrip oligo buizen, pipetten, vortex, rekken, experimentele gebied en handschoenen gedragen door de onderzoeker met RNase decontaminatie oplossing voor potentiële RNase vervuiling te verwijderen voordat alles begint. Gebruik RNase-vrij water, chemische reagentia, buizen en pipetpunten in alle stappen. Elke stap in dit experiment moet worden RNase-vrij.
2. Resuspendeer de Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo ontvangen van de onderneming tot 250 pmol / ul voorraad oplossing met RNase-vrij water en vortex krachtig om de pellet te ontbinden. Bewaren bij -80 ° C.
3. Vlak voor de transformatie, dooi de RNA-bevattende oligo op het ijs en vul aan tot 50 pmol / ul met RNase-vrij water in RNase-vrij buizen. Elke transformatie vereist een nmol van het RNA-bevattende oligo's.
4. Denatureren een gekozen bedrag van het RNA-bevattende oligo's op de 100 ° C verwarmen blok voor 2 minuten naar secundair structuren van de oligos te elimineren.
5. Onmiddellijk na denaturatie plaats de buis op ijs. Te houden op ijs tot transformatie.
6. Als controle in het experiment een overeenkomstige DNA-oligo alleen wordt gebruikt. Dit oligo is ontdooid van -20 ° C en voorbereid voor de transformatie als de RNA-bevattende oligo, zoals hierboven beschreven.

C. transformatie van gistcellen met behulp van de RNA-bevattende Oligo

1. Inoculeer 5 ml van de rijke YPD vloeibaar medium met de trp5 mutant gistcellen en groeien bij 30 ° C gedurende de nacht (zie ook Materiaal).
2. Overdracht 1,5 ml van de overnacht cultuur in 50 ml YPD vloeibaar medium.
3. Incubeer cellen in een 30 ° C shaker (225 rpm) voor 4 uur.
4. Bereid Oplossing 1 en Oplossing 2 immediately voor transformatie in RNase-vrij buizen (zie ook Materiaal).
5. Breng de celcultuur om een ​​50 ml RNase-vrij buis en draaien op 3000 rpm, wat overeenkomt met 1562 g, gedurende 2 minuten. De pellet van de cel neerslag is ongeveer. 0,3 cm ^3.
6. Verwijder het supernatant en was cellen met 50 ml RNase-vrij water en draaien op 3000 rpm gedurende 2 minuten.
7. Herhaal stap 6 voor 5 keer om zich te ontdoen van het kweekmedium en RNases die aanwezig kunnen zijn in het medium zo veel mogelijk.
8. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml van oplossing 1 en draaien op 3000 rpm gedurende 2 minuten.
9. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 250 ul van een oplossing. Deze hoeveelheid cellen is voldoende voor 7-8 transformaties.
10. Aliquot 50 pi van de celsuspensie in RNase-vrije microcentrifugebuizen, voeg 20 ul van RNA-bevattende oligo werkoplossing (1 nmol), of 20 ul van DNA-only oligo werkoplossing (1 nmol), of 20 ul steriel water zonder oligo voor de negatieve controle. Voeg vervolgens 300 pl Oplossing 2 voor elke transformatie reactie. Er is geen noodzaak om zalmsperma DNA toe te voegen in het proces van transformatie, zoals de oligos fungeren als drager zelf.
11. Vortex krachtig te mengen componenten homogeen.
12. Incubeer transformatie reacties bij 30 ° C gedurende 30 min in een shaker.
13. Heat shock bij 42 ° C gedurende 15 minuten.
14. Spin down-cellen bij 5000 tpm, wat overeenkomt met 2.236 gram, voor 4 minuten.
15. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 100 ul steriel water.
16. Neem een ​​deel van deze celsuspensie en verdunnen met steriel water met 100.000 maal en plaat cellen op een YPD plaat met behulp van ca.. 15 steriele glazen kralen en incubeer bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
17. Plaat alle geresuspendeerd cellen van elke transformatie reactie op een petrischaal van synthetisch compleet vast medium zonder tryptofaan (SC-Trp) met behulp van ca.. 15 steriele glazen kralen en incubeer bij 30 ° C gedurende 4-5 dagen (figuur 2).

D. Analyse van Gene Correctie door de RNA-bevattende Oligo

1. Tel het aantal kolonies gegroeid op het selectieve medium (Figuur 2) en op YPD medium om het gen correctie frequentie te berekenen voor de RNA-bevattende oligo, de DNA-only oligo en voor de no-oligo controle. Vergelijk de verkregen nummer. Spontane terugkeer tarief van de trp5 allelen met de twee-base deleties en de nonsense mutatie is minder dan 10-9 in de gebruikte giststam, dus we verwachten geen koloniën formatie op het selectieve medium als er geen oligo's worden toegevoegd aan de cellen.
2. Streak uit diverse willekeurig transformant kolonies opgepikt op YPD middellange tot enkele kolonie isoleert te verkrijgen. Wacht twee dagen voor de kolonie groei, vervolgens een aantal (minimaal 5) enkele kolonies en maken vlekken op YPD en op selectief medium.
3. Ontwerp een paar primers in de regio (250-1,000 bp) het doelwit van de RNA-bevattende oligo door de kolonie PCR (figuur 1B) te versterken. De procedure voor kolonie PCR is als volgt (gewijzigd uit Storici en Resnick, 2006 ^2).
   1. Resuspendeer cellen (ca. 1 mm3) genomen uit de individuele patches in 50 ul van het water en voeg een eenheid van lyticase. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min, gevolgd door incubatie in een warmte-blok bij 100 ° C gedurende 5 minuten naar de cellen en laat genomische DNA in oplossing te breken.
   2. PCR-condities: De PCR-reactie omvat 10 ul van de cel resuspensie oplossing, 50 pmol elk van de voor-en achteruit primers, is een ui 10 mM dNTPs, een eenheid van Taq-polymerase, 5 ul van 10x buffer en aangepast met steriel water om een eindvolume van 50 pi. Het PCR-programma is 3 min bij 95 ° C, 30 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 55 ° C, en een min bij 72 ° C, een laatste verlenging tijd van 7 minuten bij 72 ° C, dan monsters worden bewaard bij 4 ° C. Een verlenging tijd van 1 min / kb is aangenomen voor deze reactie.
   3. Na de PCR worden stalen draaien op een 1% of 2% (afhankelijk van de verwachte grootte van het PCR-product) agarosegel voor observatie van de PCR-product (figuur 3).
4. Als de genetische informatie overgedragen door de RNA-bevattende oligo genereert een nieuwe beperking site in de gist genomische doelregio (Figuur 1B), is het mogelijk om de juiste overdracht van informatie te verifiëren door het verteren van het PCR-product met de juiste restrictie-enzym. Als er geen restrictie site wordt gegenereerd door de RNA-bevattende oligo, ga dan naar stap 6. Digest PCR-producten met een specifieke restrictie-enzym. De spijsvertering reactie omvat 6 pi PCR-product, buffer, BSA (misschien niet nodig zijn voor sommige enzymen, zie instructie voor de gebruikte enzym), 0,5 pi van restrictie-enzym, en steriel water tot 15 pl. Monsters worden geïncubeerd gedurende 1 uur bij de temperatuur die specifiek zijn voor het gebruikte enzym.
5. Runnen samen een onverteerd monster met de verteerde monsters op dezelfde rij van een 2% agarose gel met de genetische modificatie in acht overgedragen by de RNA-darmkanaal van het RNA-bevattende oligo (figuur 3).
6. Zuiver PCR-producten met behulp van een PCR zuivering kit en voor te bereiden hen voor DNA-sequencing. Monsters voor sequencing met dezelfde primers gebruikt om het product te versterken.
7. Analyseren van DNA-sequencing resultaten met behulp van software die uitlijning van meerdere sequenties met een gekozen referentie sequentie (figuur 4) mogelijk maakt.

E. Alkali Behandeling van de RNA-bevattende oligo (figuur 5)

1. Voor elke reactie, voeg 1 nmol (4 pl van 250 pmol / ul voorraad-oplossing) van het RNA-bevattende oligo, of DNA-oligo in een 1.5 ml buis.
2. Voeg 4 ul van 1 M NaOH voor hydrolyse, of als alternatief 4 ul H ₂ O toe te voegen als negatieve controle, en incubeer bij 65 ° C in een waterbad gedurende 1 uur Verplaats vervolgens uit het waterbad met ijs.
3. Neutraliseren met 2 pi van 1,2 M HCl, 4 ul van 1 M Tris-HCl, en 4 pi H ₂ O, of als alternatief 6 pi van H ₂ O en 4 pl van 1 M Tris-HCl voor de negatieve controle. Te houden op ijs tot transformatie.

Figuur 1. Schematische weergave van het defecte gen en trp5 van de TRP5 allel gecorrigeerd door de RNA-bevattende oligo. A) De trp5 mutant gen bevat een 2-base wissen (zwarte driehoeken) en 1-base nonsense mutatie (asterisk). De single-streng RNA-bevattende oligo met 2-base inbrengen (blauwe lus) en 1-RNA-base substitutie (rode rechthoek) het genereren van een Van91 ik restrictie-enzym site (aangegeven door de beugel) wordt omgezet in gistcellen naar de genetische defecten te corrigeren van de trp5 gen. B) Na de TRP5 gen wordt gerepareerd door de RNA-bevattende oligo (gecorrigeerd bases worden aangeduid als blauwe rechthoeken), is de Van91 ik website gegenereerd in de TRP5 gen. Een 278 bp fragment met alleen een Van91 ik restrictieplaats in TRP5 gen is PCR versterkt door een paar primers (P1 en P2). De 177 bp en 101 bp fragmenten gegenereerd na vertering van de P1 en P2 PCR-product door Van91 I worden ook getoond.

Figuur 2. Transformatie resultaat met de RNA-bevattende oligo. A) Gistcellen getransformeerd met geen oligo hebt geen kolonies vormen op de SC-Trp medium, zie borden ab. B) Platen cg tonen gist kolonies groeien op SC-Trp na cellen getransformeerd met een nmol van het RNA-bevattende oligo. C) Platen hl tonen gist kolonies groeien op SC-Trp na cellen getransformeerd met een nmol van het overeenkomstige DNA-only control oligo.

Figuur 3. Detectie van genetische overdracht van informatie van de RNA-bevattende oligo om gist chromosomale DNA door restrictie digestie van het PCR-product het versterken van de beoogde genomische regio. 2% agarose gelelektroforese van PCR-monsters versterkt door P1 en P2 en gedigereerd met Van91 ik restrictie-enzym. Lanen 1, 8 en 15, DNA-ladder met afmetingen van 100, 200, 300, 400 en 500 bp aangegeven op de links, laan 2, PCR-product van trp5 locus geamplificeerd uit het genomisch DNA van de trp5 mutante stam, baan 3, PCR product geamplificeerd uit genomisch DNA afkomstig van een Trp + kolonie doelwit van de DNA-only oligo; rijstrook 4-7, PCR producten geamplificeerd uit genomisch DNA afkomstig van Trp + kolonies doelwit van de RNA-bevattende oligo; laan 9 tot 14, Van91 ik restrictievertering van de PCR-producten van lanen 2 tot 7. De aanwezigheid van de onversneden PCR-product bands in rijstroken 10 tot 14 kan verklaard worden door een gedeeltelijke vertering door Van91 ik bij de TRP5 locus (CCACATTCTGG). Gezien het feit dat de snij-site voor Van91 I (CCANNNN NTGG) kan meerdere sequenties hebben, kan de site gegenereerd in TRP5 niet de meest optimale doelstelling voor het enzym. In feite, na DNA-sequentie van alle bovenstaande PCR-producten die we detecteren geen extra veranderingen dan die gedragen door de oligo's (zie figuur 4). Het 278 bp PCR-band versterkt door P1 en P2 primers en de spijsvertering product bands door Van91 I van 177 bp en 101 bp worden weergegeven door de pijlen aan de rechterkant.

Figuur 4. DNA-sequencing resultaten laten zien gen correctie door de RNA-bevattende oligo. A) DNA electropherogram van de genomische regio het doelwit van de RNA-bevattende oligo. De G in de DNA-volgorde (blauwe doos) afkomstig is van de RG op de RNA-bevattende oligo. Ook boxed is het inbrengen van de CG basen. Sequencing resultaten van alle andere PCR-producten zijn ook zo helder als deze, met TL-signalen ver boven de achtergrond. B) sequenties van de TRP5 regio van de Trp + transformants doelwit van de DNA-only oligo (T1) en de RNA-bevattende oligo (T2-T5) wedstrijd in de consensus-sequentie op de top en worden vergeleken met die van de trp5 mutant cellen voor targeting op basis van de oligo's (Genomic DNA, rood gearceerd). De reparatie RNA-bevattende oligo aan de onderkant heeft twee-base DNA inbrengen en een-base (G) RNA substitutie rood gemarkeerd. De regio's verpakt in blauw met gele tint laten zien dat de RNA-bevattende oligo als de DNA-only oligo precies gecorrigeerd de verwijdering mutatie en nonsense mutatie in alle geteste monsters. De stippellijnen markeren de positie van de RNA-bevattende oligo volgorde. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 4 te zien.

Figuur 5. Alkali-behandeling voorkomt gen correctie door de RNA-bevattende oligo. De transformatie frequentie van de RNA-bevattende oligo (R) is weergegeven in de rode balk en dat door de DNA-only oligo (D) wordt getoond in de blauwe balken. De fout balken geven de standaardfout van het gemiddelde voor de drie onafhankelijke transformaties voor elke oligo. De DNA-only oligo displays vergelijkbare modificaties frequentie zonder en met NaOH behandeling. Anders, transformatie frequentie door de RNA-bevattende oligo daalt naar 0 na behandeling met NaOH. Daarom is de voorbereiding met de RNA-bevattende oligo niet besmet is met DNA-only oligo, dus de waargenomen frequentie van transformatie is specifiek voor de RNA-bevattende oligo.

Discussie

Het feit dat RNA kan genetische informatie direct over te dragen aan genomisch DNA in de cellen werd ontdekt benutten van het gebruik van synthetische RNA-bevattende oligo (Dharmacon gesynthetiseerd-oligo's) ^1. Het was het bewijs van het principe dat cellen kunnen RNA-bevattende moleculen of RNA-sequenties alleen te gebruiken als sjablonen voor DNA-synthese. Het gebruik van RNA-bevattende oligo's leidde niet alleen tot de demonstratie dat genetische informatie kan direct worden overgedragen van RNA naar genomisch DNA zonder de noodzaak van een reverse getranscribeerd DNA-kopie intermediair, maar ook om het bewijs dat RNA kan worden gebruikt als homologe template in de reparatie van een DNA-schade ^1,3. De oligo kan worden gemaakt van RNA-only of bevatten slechts een enkele ribonucleotide ingebed in een DNA-sequentie, zoals in het voorbeeld dat we hier gepresenteerde. Het RNA-bevattende oligo heeft een ingebouwde ribonucleotide ontworpen om de nonsense mutatie in het genoom defecte trp5 allel te corrigeren. De overdracht van genetische informatie van de ribonucleotide om de genomische DNA wordt onthuld door een verandering in fenotype (cel groeien op het medium zonder tryptofaan) van de beoogde cellen. De frequentie van gen-correctie verkregen met de RNA-bevattende oligo wordt gemeten en vergeleken met die van een controle DNA-only oligo. Door het uitvoeren van dit gen correctie test in verschillende cel achtergronden, waar we muteren verschillende gist genen, kunnen we ontdekken die specifiek factor / s van invloed zijn gericht op door de RNA-bevattende oligo's. Zo kunnen we laten zien mechanismen hoe cellen van de stabiliteit van RNA / DNA hybriden te reguleren. Door simpelweg het ontwerpen van verschillende varianten van het RNA-bevattende oligo's kunnen we bepalen de kans voor een bepaalde RNA-darmkanaal als template dienen in DNA-modificatie en kunnen we de stabiliteit van specifieke RNA-sequenties ingebed in DNA te bepalen. Bovendien kunnen we vaststellen wat de voorkeur in vivo substraten voor factoren die de interactie met RNA / DNA hybriden.

Terwijl de verschillende in vitro studies, voornamelijk gebruik te maken van korte RNA-bevattende oligos, zijn uitgevoerd om de functie van factoren die RNA kan in een hybride te herkennen met DNA, zoals het RNase H enzymen ^4, de in vivo functies van RNases H en karakteriseren als de identiteit van andere eiwitten die van invloed kunnen zijn RNA / DNA hybride stabiliteit blijven meestal onbekend. De mogelijkheid om gebruik te maken RNA-bevattende oligo's van een aanzienlijke lengte (50 tot 80-mers) en een optimale kwaliteit (zoals Thermo Scientific Dharmacon RNA-bevattende oligo's) heeft de weg openen voor de behandeling van een breed scala aan moleculaire processen direct in vivo in de cellen van belang. Zoals te zien in deze video, transformatie met behulp van RNA-bevattende oligo's vereist in wezen slechts een paar extra stappen in vergelijking met de transformatie met behulp van DNA-moleculen, om degradatie te voorkomen door RNases. Zo kan de transformatie met behulp van RNA-bevattende oligo's is niet beperkt tot de gist systeem, maar worden toegepast op een organisme of cel type waar transformatie door DNA-oligo is bedreven.

Tot slot, gericht op cellen door RNA-bevattende oligo's biedt de mogelijkheid om RNA / DNA hybriden en ribonucleotiden ingebed in DNA in vivo in de cellen te genereren. De stabiliteit, functie en gevolgen van deze in vivo gegenereerde RNA / DNA hybriden kunnen worden geanalyseerd en gekarakteriseerd, potentieel blootleggen van onbekende mechanismen van DNA-herstel en onthullende nieuwe strategieën voor gen-targeting.

Materialen