Deze video laat zien hoe u auto-immune hypophysitis induceren in SJL muizen en hoe u de ernst ervan te beoordelen door de histopathologie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis in SJL Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Auto-immune hypophysitis kan experimenteel worden gereproduceerd door de injectie van hypofyse eiwitten gemengd met een adjuvant in een gevoelig muizen. Muismodellen ons in staat stellen om te bestuderen hoe ziekten zich ontvouwen, vaak het verstrekken van een goede replica van dezelfde processen die zich voordoen bij mensen. Voor sommige auto-immuunziekten, zoals het type 1A diabetes, zijn er modellen (de NOD muis), die spontaan ontwikkelen van een ziekte lijkt op de menselijke tegenhanger. Voor veel andere auto-immuunziekten, maar het model moet experimenteel worden opgewekt. Een gemeenschappelijke aanpak in dit verband is de muis te injecteren met een dominante antigeen afgeleid van het orgel wordt bestudeerd. Bijvoorbeeld, onderzoekers geïnteresseerd in auto-immuun thyreoïditis injecteren muizen met thyroglobuline 2, en die geïnteresseerd zijn in myasthenia gravis hen te injecteren met de acetylcholine receptor 3. Als de autoantigen voor een bepaalde auto-immuunziekte is niet bekend, onderzoekers injecteren een ruw eiwit uittreksel uit het orgel het doelwit van de auto-immuunreactie. Voor auto-hypophysitis, de pathogene autoantigen (s) nog moeten worden geïdentificeerd 4, en dus een ruwe hypofyse eiwit preparaat wordt gebruikt. In deze video artikel zullen we laten zien hoe experimentele auto-immune hypophysitis in SJL muizen induceren.
Protocol
Experimentele Protocol
Zodra de hypofyse immunogeen is voorbereid (zie begeleidend artikel), is het subcutaan geïnjecteerd in SJL muizen (The Jackson Laboratories, voorraad 000.686). Een tweede identieke injectie is 7 dagen later herhaald. Muizen worden vervolgens gebruikt voor het verzamelen in vivo-en post-mortem resultaten.
Stap 1. Subcutane injectie van hypofyse immunogeen in SJL muizen
Muizen worden eerst verdoofd door het injecteren van 0,5 ml van 20 mg / ml 2,2,2-tribroomethanol (Avertin, TCI-Amerika, T-1420) intraperitoneaal. Muizen worden dan subcutaan geïnjecteerd met 100 ul van de hypofyse emulsie dat, zoals aangegeven in de metgezel Jupiter 2181 artikel, bevat 1 mg hypofyse-extract en 0,25 mg volledig Freund's adjuvans. De emulsie wordt geïnjecteerd in het linker achterbeen dorsale regio ((50 pi) en de rechter liesstreek (50 pi). De hypofyse emulsie is weer geïnjecteerd op dag 7 in de tegenovergestelde sites (50 pl in de rechter dorsale achterbeen regio en 50 pl in de linker liesstreek). Muizen worden dagelijks gecontroleerd op de eerste 3 dagen en dan wekelijks tot de dag van het offer, die typisch is 28 dagen na de eerste immunisatie.
Stap 2. Verzameling van in vivo resultaten: Blood assays
Het weefsel meest gebruikte om experimentele resultaten te beoordelen, terwijl de muizen nog in leven zijn is bloed. Bloed wordt regelmatig getrokken 14 dagen na de eerste immunisatie om de serumspiegels van hypofyse antistoffen of andere markers, zoals cytokines en chemokines te meten.
Bloed wordt verzameld van levende muizen als volgt. Muizen worden veilig gehouden door de nekvel en de achterkant van het kaakbot is gevestigd. Zodra de achterkant van het kaakbot is gevestigd, zijn 4 mm lancetten gebruikt om doorboren de submandibulaire vasculaire bundel. Nadat het bloed wordt verzameld, plaatst u de druk op de op het gebied met behulp van een alcoholdoekje om een bloeduitstorting te voorkomen. Verzamelde bloed is gecentrifugeerd bij 2.000 g gedurende 20 minuten, en opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik.
Stap 3. Het verzamelen van post-mortem resultaten: Hypofyse histopathologie
Muizen zijn meestal opgeofferd 28 dagen na de eerste immunisatie. De kardinaal-functie nodig zijn om de diagnose van EAH te richten is de infiltratie van de hypofyse door hematopoietische mononucleaire cellen.
Muizen worden gedood door ze in een afgesloten plastic kamer die is geperfuseerd met CO 2. Muizen worden bewaard in de kamer voor een totaal van 8 minuten. Na de euthanasie, is de hypofyse verzameld zoals beschreven in het begeleidend artikel. Een zieke hypofyse verschijnt gezwollen en meer stevig aanhanger naar de omliggende dura mater. Scherpe pincet worden gebruikt om de hersenvliezen rond de hypofyse los te maken. Zodra de hypofyse beweegt zich vrij over het sphenoïd bot, het ene uiteinde van de hypofyse is gegrepen met een pincet en de hypofyse wordt zorgvuldig opgeheven. De klier wordt dan geplaatst in een microcentrifugebuis met fixatief 5 Beckstead's. De hypofyse is 's nachts vast, verpakt in papier lens, en geplaatst in een cassette. De klieren worden vervolgens verwerkt met behulp van het volgende protocol:
| Station nummer | Reagens | Tijd in minuten | Temperatuur (Celsius) |
| 1 | 70% alcohol | 5 | 25 |
| 2 | 70% alcohol | 15 | 25 |
| 3 | 95% alcohol | 15 | 25 |
| 4 | 95% alcohol | 15 | 25 |
| 5 | 100% alcohol | 15 | 25 |
| 6 | 100% alcohol | 7.5 | 25 |
| 7 | 100% alcohol | 7.5 | 25 |
| 8 | xyleen | 20 | 25 |
| 9 | xyleen | 20 | 25 |
| 10 | xyleen | 20 | 25 |
| 11 | paraffine | 30 | 58 |
| 12 | paraffine | 5 | 58 |
| 13 | paraffine | 5 | 58 |
Na verwerking zijn hypofyse ingebed in paraffine en ten minste vijf niet-opeenvolgende secties (5-um dik) worden gesneden van elke klier. Na het snijden worden de klieren gekleurd met hematoxyline en eosine, en geanalyseerd om de mononucleaire infiltratie kwantificeren. De sectie met de meest ernstige infiltratie is geselecteerd voor het scoren. De ernst wordt gescoord op basis van een subjectieve inschatting van de omvang van de hypofysevoorkwab vervanging of vernietiging door immuuncellen: graad 0, geen ziekte, graad 1, 2% -20% betrokkenheid; graad 2, 20% -30%, graad 3, 30% -50%, graad 4, 50% -90%, klasse 5, meer dan 90%. Alle onderdelen worden gescoord door twee personen verblind om de bron van de secties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vier technieken zijn gemeld hypophysitis te induceren in proefdieren. De techniek wordt beschreven in dit artikel, dat is de injectie van hypofyse eiwitten gemengd met adjuvans Freund s, is de oudste, dateert uit 1967 6, en is meer recent een verbeterd. Andere technieken zijn de injectie van oplosbare rubellavirus glycoproteïnen in 1992 7, de stereotactische injectie van een adenovirus rechtstreeks naar de hypofyse in 2002 acht, en de transplantatie van hypofyse van een rat st...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie DK080351 naar de PC, en door een gulle gift van de Terry en Kristine Gore familie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| SJL-muizen (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribroom–ethanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixatief |
Referenties
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
- Twarog, F. J., Rose, N. R. The production of thyroid autoantibodies in mice. J Immunol. 101, 242-2450 (1968).
- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
- Levine, S. Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland. Science. 158, 1190-1191 (1967).
- Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy. Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).
- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. Adenohypophysitis in rat pituitary allografts. Int J Exp Pathol. , (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
