Testen Protozoacidal Activiteit van Ligand-lytische Peptiden Against Protozoa Termite Gut In vitro (Protozoa Cultuur) en In vivo (Micro-injectie in Termite einddarm)

Samenvatting

We presenteren de procedures aan te tonen dat liganden binden aan het oppervlak membraan van de protozoa cellulose verterende protozoa in de darm van de Formosan ondergrondse termieten met behulp van fluorescentie microscopie en dat liganden gekoppeld aan lytische peptiden kill deze In vitro (Anaërobe protozoa cultuur) en In vivo (Injectie in de termiet einddarm).

Samenvatting

We ontwikkelen een nieuwe benadering voor ondergrondse termieten controle die zou leiden tot een verminderde afhankelijkheid van het gebruik van chemische bestrijdingsmiddelen. Ondergrondse termieten zijn afhankelijk van protozoa in het hindguts van de werknemers om efficiënt te verteren hout. Lytische peptiden is aangetoond dat een verscheidenheid van protozoaire parasieten (Mutwiri et al.. 2000) te doden en ook protozoa in de darm van de onderaardse ondergrondse termiet, Coptotermes formosanus (Husseneder en Collier 2009). Lytische peptiden zijn onderdeel van het niet-specifieke immuunsysteem van eukaryoten, en vernietigen de membranen van micro-organismen (Leuschner en Hansel 2004). De meeste lytische peptiden zijn niet waarschijnlijk dat hogere eukaryoten kwaad, omdat ze geen invloed hebben op de elektrisch neutrale cholesterol-bevattende celmembranen van hogere eukaryoten (Javadpour et al.. 1996). Lytische peptide actie kan worden gericht op specifieke celtypen door de toevoeging van een ligand. Bijvoorbeeld, Hansel et al. (2007). Meldde dat lytische peptiden geconjugeerd met kanker celmembraan receptor liganden kan worden gebruikt om borstkanker cellen te vernietigen, terwijl de lytische peptiden alleen of geconjugeerd met niet-specifieke peptiden werden niet effectief. Lytische peptiden ook zijn geconjugeerd aan menselijke hormonen die aan receptoren binden op tumorcellen voor gerichte vernietiging van prostaat-en teelbalkanker cellen (Leuschner en Hansel 2004).

In dit artikel presenteren we technieken die gebruikt worden om de protozoacidal activiteit van een lytische peptide (Hecate) gekoppeld aan een heptapeptide ligand dat bindt aan het oppervlak membraan van protozoa uit de darm van de onderaardse ondergrondse termiet te tonen. Deze technieken zijn uitroeiing van de darm van de termiet werknemers, anaërobe cultuur van de darm protozoa (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), microscopische bevestiging dat de ligand gemarkeerd met een fluorescerende kleurstof bindt aan de termiet darmen protozoa en andere vrijlevende protozoa maar niet om bacteriën of darmweefsel. We tonen ook aan dat dezelfde ligand gekoppeld aan een lytische peptide efficiënt termiet darm protozoa in vitro (protozoa cultuur) en in vivo (micro-injectie in de einddarm van de werknemers) doodt, maar is minder bacteriacidal dan de lytische peptide alleen. Het verlies van protozoa leidt tot de dood van de termieten in minder dan twee weken.

In de toekomst zullen we genetisch ingenieur micro-organismen die kunnen in de termiet einddarm en verspreid te overleven door middel van een termiet kolonie als 'Trojan Horses' op ligand-lytische peptiden die zou doden de protozoa in de termiet darm en vervolgens dood de termieten in de kolonie te drukken . Ligand-lytische peptiden ook nuttig kan zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen protozoaire parasieten.

Protocol

Experiment 1: Extractie van termieten darm protozoa onder anaërobe omstandigheden

1. Gebruik een ventilator box (Coy Laboratories) in een handschoenenkastje om voortdurend lucht te laten circuleren door middel van een droogmiddel en type D katalysator Stak-Paks voor vocht en zuurstof niveaus controle en ongelijke temperatuur te voorkomen. Vul het dashboardkastje met een continue stroom van stikstof gedurende 20 tot 30 minuten. Monitor zuurstof niveaus met een zuurstofsensor (C-kwadraat, Inc) gedurende 1 uur Gebruik stikstof te bereiken en behouden anaërobe omstandigheden wanneer dat nodig is.
2. Bereid Trager U media (Trager 1934) en de pH instellen op 7,0. Besproeien van het filter gesteriliseerd media in het dashboardkastje met een mengsel van 2,5% waterstof, 5% kooldioxide en 92,5% stikstof gedurende 1 uur om zuurstof te verwijderen.
3. Silaniseren alle materialen inclusief microscoopglaasjes, microcentrifuge buizen, pipetten, glaswerk ed gebruikt in de experimenten met Sigmacote om adsorptie van protozoa te voorkomen of peptiden aan oppervlakten (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / medialib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf).
4. Sinds protozoa termiet darmen zijn strikt anaërobe organismen die ze mogen niet worden blootgesteld aan zuurstof. Daarom zijn de volgende stappen worden uitgevoerd onder anaërobe omstandigheden in een handschoenenkastje (zie 1.1). Met een pincet onderdompelen het hele lichaam van een termiet werknemer in 70% ethanol en voorzichtig omzwenken voor ongeveer 10 s aan de oppervlakte verontreinigingen te verwijderen.
5. Haal de werknemer uit de ethanol en laat ze drogen op een schone Kimwipe voor ongeveer 20 s. Gebruik een steriele fijne punt tang aan de werknemer buik te houden en het uiteinde van de buik te pakken met een ander paar tang trek de darm omhoog of omlaag in een hoek van 45 graden. Als de darm wordt getrokken in een rechte hoek en met te veel kracht is het waarschijnlijk om uiteen te vallen. Plaats 10 lef in een daling van 100 ui Trager U media op een microscoopglaasje.
6. Doorboren het lef met een paar steriele fijne ontleden sondes vrij te geven van de protozoa en voorzichtig de darminhoud overdracht met een 200 ul pipet in een 1 ml microcentrifugebuis met 900 ul Trager U media. Na aftrek van sedimentatie van de darmwand fragmenten (5 s), overdracht 900 ul van de supernatant naar een nieuwe buis.
7. Breng 10 ul van protozoa cultuur een sigmacoted microscoopglaasje en controleer de conditie van protozoa onder een microscoop op 200 X vergroting.
8. Bereid controle culturen van de aërobe protozoa Tetrahymena pyriformis, Amoeba sp., Euglena sp., En Paramecium sp. (Carolina Biologische Supply Company, Burlington, NC) en een 's nachts cultuur van Escherichia coli in de cultuur media aanbevolen door de leverancier.

Experiment 2: Voeg ligand gekoppeld aan een fluorescente kleurstof om de protozoa en de bacterie culturen om te testen voor het binden aan het oppervlak membranen en celwanden

We hebben eerder gebruikte faag display bibliotheken (New England Biolabs Inc, Ipswich, MA) tot 19 heptapeptide sequenties die zich binden aan protozoa (protocollen beschikbaar op http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf) te identificeren. Een ligand met een peptide sequentie (ALNLTLH) die overeenkomsten vertoont met vermeende glycoproteïnen bekend van de Trypanosoma brucei membraan toonde werd gesynthetiseerd en gekoppeld aan een C-terminale fluorescente probe (EDANS, 5 - ((2-aminoethyl) amino) naftaleen-1-sulfonzuur zuur, λmax = 341 nm, 471 nm λem =) via solid state peptide synthese (SSPS) met de EDANS NovaTag hars (EMD Biosciences). Hier laten we zien dat het ligand bindt aan de protozoa die werden geïsoleerd uit de termiet darmen en andere vrijlevende protozoa, maar niet voor bacteriën.

1. De cultuur van de protozoa, zoals beschreven in Exp. 1. Fix protozoa met 10% formaldehyde bij 4 ° C gedurende 12 uur
2. Centrifugeer de protozoa-oplossing (30 xg, 10 min), gooi het supernatant af en was het pellet met de vaste twee keer protozoa in 1 ml Trager U media. De pellet opnieuw te schorten in 1 ml Trager U media. Ook fix andere protozoa, en E. coli-bacteriën voor controles.
3. Incubeer de vaste micro-organismen voor 1-2 uur met een oplossing van gesynthetiseerde ligand gekoppeld aan de fluorescerende kleurstof EDANS (opgesteld in water) bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM. De ligand lost beter in water dan Trager U media.
4. Let op de micro-organismen onder een fluorescentiemicroscoop op 400 X vergroting op een absorptie maximum bij 341 nm en een emissie in de blauwe regio op 471 nm.

Experiment 3: Het testen protozoacidal activiteit van het ligand gekoppeld aan een lytische peptide in vitro (protozoa cultuur)

Een conjugaat van het ligand en de lytische peptide Hecate (Mutwiri et al.. 2000) werd eerder gesynthetiseerd in de LSU Protein Facility.

1. Silaniseren materialen en voor te bereiden termiet darm protozoa cultuur in de anaërobe handschoenenkastje eens beschreven in Exp. 1.
2. Bereid culturen van aerobe controle micro-organismen (zoals E. coli en de vrijlevende protozoa soorten T. pyriformis).
3. In de anaërobe omgeving van het handschoenenkastje, pipet 6 porties van 198 ul van protozoa cultuur in 0,5 ml Eppendorf buizen. Voeg 2 pi van een 100 pM oplossing van ligand-lytische peptide tot de helft van de fracties (eindconcentratie 1 uM) van de termiet darm protozoa cultuur. Voeg 2 pl water om de andere helft van de monsters (controles).
4. Op het werkblad, voor te bereiden soortgelijke aliquots van E. coli en T. pyriformis met 1 uM lytische peptide, ligand-lytische peptide of water.
5. Na 1 uur, overdracht 10 ul van elk protozoa cultuur naar de dia's. Vergelijk de overleving van de behandelde protozoa met die van controles onder een microscoop op 200 X vergroting.
6. Na 1 uur, plaat 100 ul van ca.. 10 ^-4 verdunning van de E. coli culturen op BHI en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht. Vergelijk het aantal kolonievormende eenheden op de borden.

Experiment 4: Injectie van het ligand gekoppeld aan een fluorescerende kleurstof in de termiet einddarm

1. Trek naalden (model GD-1, 1 X 900 mm) met behulp van een Narishige PC-10 glazen micropipet trekker met een tweetraps warmte-niveau (65 en 48) om een ​​tip grootte van 20-30 micrometer te verkrijgen. Bevestig de tip grootte door het meten van het onder een microscoop met behulp van een micrometer.
2. Vul een naald met ca. 30 pi van 50 uM van fluorescent gemarkeerde ligand gesuspendeerd in water met behulp van een injectiespuit bevestigd. Vul een andere naald met water voor de controle. Bevestig een micropipet (0,5 ul capaciteit en 32 mm lengte, Drummond Scientific Company) aan een houder in een micromanipulator. Bevestig een naald aan de injectie-systeem houder in een seconde micromanipulator. Stel eerste injectie parameters van ongeveer 1 s puls lengte en 10-12 psi injectie. Duw de naald in de micropipet en injecteer de oplossing om met een pedaal aangedreven high-speed elektronische injectie systeem met een pulslengte controle bevestigd aan een gecontroleerde stikstof-gasstroom, die ervoor zorgt dat een constant volume reproduceerbaar is geïnjecteerd. Na injectie, verwijder de micropipet en noteer de lengte van de geïnjecteerde oplossing met behulp van een schuifmaat. Bereken het geïnjecteerde volume van het bekende parameters van de micropipet. Stel de druk van stikstof en de puls lengte tot 0,3 ul-oplossing uit te zetten in een enkele injectie.
3. Knijp het einde van een termiet werknemer buik met zachte tang op een uitwerpselen aanwezig te verwijderen in het rectum. Immobiliseren termiet werknemer door koeling ze op ijs gedurende 5 minuten.
4. Maak ontvangers voor het houden van termieten werknemers door het afsnijden van 100 ui pipetpunten met behulp van een scalpel. Snijd de tip om een ​​lengte van 10 - 12 mm en het gebruik volgens de grootte van de termieten.
5. Bevestig de ontvanger aan de micromanipulator. Plaats een werknemer op een petrischaal op zijn dorsale zijde en de eerste zuig de werknemer kop in de ontvanger met behulp van een stikstof zuigpomp, zodat het eindpunt van de werknemer steekt uit de ontvanger.
6. Houd de termiet in de ontvanger, zorgvuldig van tevoren de gevulde naald met behulp van de micromanipulator om te plaatsen in werker anus. Injecteer 0,3 ul van de oplossing (fluorescent gemerkt ligand of water voor controles).
7. Plaats de arbeiders geïnjecteerd met ligand of water in afzonderlijke petrischaaltjes met vochtig filtreerpapier en ze op 26 te houden ± 2 ° C met 78% RV
8. Uitroeien lef van de geïnjecteerde termieten en het verzamelen van de protozoa na 24 uur, zoals hierboven in Exp getoond. 1. Fix en observeer de protozoa zoals getoond in Exp. 2.

Experiment 5: Testen protozoacidal activiteit van het ligand gekoppeld aan een lytische peptide in vivo (injectie in termiet einddarm)

1. Silaniseren materialen zoals beschreven in Exp. 1.
2. Bereid een 500 uM oplossing van het ligand-lytische peptide in het water.
3. Volg stap 3.1) tot 3.4) op glas naalden, ontvangers en termieten werknemers voor te bereiden.
4. Naar aanleiding van de methoden beschreven in 3.5) 0.3 ul van ligand-lytische peptide-oplossing (behandeling) of water (controle) te injecteren in de einddarm van 20 termieten werknemers.
5. Houd termieten gedurende 24 uur, uit te roeien lef van verschillende werknemers en observeren darminhoud onder de microscoop, zoals beschreven in 3.6). en 3.7).
6. Zodra een overlijden van protozoa in de termiet darm wordt bevestigd, blijven de resterende behandeld termieten en controles in petrischalen met vochtig filtreerpapier en dagelijks observeren sterfte.

Representatieve resultaten:

Experiment 1: Meestal voordarm, middendarm en einddarm zijn verkregen in een stuk, indien de procedure correct is gevolgd (figuur 1a). De protozoa wonen in hoge dichtheid in de anaërobe delen van de einddarm en kan worden vrijgegeven door de einddarm piercing met een pincet (Figuur 1b 1 & 2). De grootste protoZOA soorten in de darm van de onderaardse ondergrondse termiet is de spindel-vormige P. grassii, dat is 200 tot 300 micrometer lang en 150 micrometer breed en kan gezien worden met het blote oog. De tweede grootste soort is de peer-vormige H. hartmanni (50 tot 140 micrometer lang en 30 tot 80 micrometer breed). De kleinste soort is de kegelvormige S. leidyi (15-50 micrometer lang en 80-30 micrometer breed;. Lai et al. 1983). De protozoa soorten zijn weergegeven in figuur 2.

Onder optimale kweekomstandigheden van de drie soorten protozoa geïsoleerd uit de darm van de Formosan ondergrondse termieten zullen levend en gezond blijven voor ten minste 72 uur in anaërobe Trager U media (figuur 3a). Echter, als de cultuur omstandigheden niet optimaal zijn protozoa zullen sterven snel. Als er zuurstof residuen in de media, zal de beweging van de protozoa onmiddellijk te staken. Als de osmotische druk te hoog is of membraan integriteit is het oppervlak membraan van de protozoa zal uitpuilen en de cellen scheuren (figuur 3b) gecompromitteerd. Als osmotische druk is te laag of membranen in gevaar komen, zullen protozoa verschrompelen en krimpen (figuur 3c).

Experiment 2: We hebben bevestigd dat de ligand gekoppeld aan een fluorescente probe gebonden aan alle drie de soorten van protozoa uit de einddarm van Formosan ondergrondse termieten in detecteerbare dichtheden. Ligandbinding gebeurt op de hele cel oppervlak (figuur 4). Bindingsplaatsen zijn geconcentreerd in het voorste deel van de protozoa op de axostyle (een vel van microtubuli) en de kern in P. grassii.

We zagen enige fragmentarische autofluorescentie van hout deeltjes opgenomen door de protozoa. Echter, autofluorescentie is meestal gemakkelijk te onderscheiden van specifieke binding van het ligand, omdat er geen autofluorescentie van het oppervlak, de axostyle en de kern (figuur 4).

We hebben ook geconstateerd fluorescentie in alle geteste vrijlevende aërobe protozoa soorten (figuur 5), wat suggereert dat het ligand bindt aan structuren generiek voor protozoa. Er werd echter geen ligand binding waargenomen voor E. coli.

Experiment 3: Een uM van ligand-lytische peptide gedood alle drie de soorten van protozoa uit de darm van de Formosan ondergrondse termiet werknemers en de vrijlevende T. pyriformis in vitro in minder dan 10 min, terwijl de controle bleef in leven. Figuur 6 toont het progressieve verlies van membraan integriteit van de termiet darm protozoa die behandeld worden met ligand-lytische peptide. Membranen uitstulping en scheuren, protozoa verschrompelen en sterven. Werd geen verschil waargenomen in het aantal E. coli kolonies tussen de behandelingen van ligand-lytische peptide en water. Lytische peptide met geen ligand, echter, verminderde het aantal van E. coli kolonies aanzienlijk (figuur 7). Dit suggereert dat de bevestiging van de ligand tot op zekere hoogte beschermt niet is bestemd en micro-organismen van lysis.

Experiment 4: Bij 0,3 ul 50 pM van het fluorescent gemarkeerde ligand werd geïnjecteerd in de einddarm van de termiet werknemers, binding aan P. grassii, S. leidyi en H. hartmanni werd bevestigd via fluorescentie microscopie vergelijkbaar met Exp. 2 (figuur 4). Termiet darmweefsel kwam niet opdagen fluorescentie.

Experiment 5: Injectie van 0,3 pl 500 uM ligand-lytische peptide gedood alle drie de soorten van protozoa in de darm van de Formosan ondergrondse termieten binnen 24 uur. Termieten stierven binnen 10 dagen na het verlies van hun symbiotische protozoa. Voorheen Husseneder en Collier (2009) geïnjecteerd dezelfde concentratie van lytische peptide in termiet lef. Zonder de bijgevoegde ligand, duurde het meer tijd tot de protozoa in de darm (72 h) en de termieten dood waren (zes weken). Dit suggereert dat het ligand protozoacidal efficiëntie van lytische peptiden, waarschijnlijk door het binden van de lytische peptiden aan de protozoa toeneemt.

Figuur 1. een: Formosan ondergrondse termiet gut op een dia met de belangrijkste onderdelen van de darm (voor-, mid-, einddarm), b 1 & 2: einddarm is doorboord met een tang om de darminhoud met de protozoa vrijkomen.

Figuur 2. De drie soorten van flagellaat protozoa te vinden in de einddarm van de onderaardse ondergrondse termiet: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni, en c) Spirotrichonympha leidyi.

Figuur 3. Protozoa in cultuur, een) Gezond protozoa, b) Protozoa met uitpuilende membranen, c) verschrompelde protozoa.

Figuur 4. Bevestiging van de binding van het ligand gekoppeld aan een fluorescente probe aan darm termietprotozoa (van boven naar beneden: P. grassii, H. hartmanni, S. leydi), behandeld met fluorescent gemerkt ligand en onbehandelde controles (te zien autofluorescentie).

Figuur 5. Ligand binding aan vrij levende aërobe protozoa, a) Tetrahymena, b) Amoeba, c) Euglena, en d) Paramecium.

Figuur 6. Behandeling van protozoa met een) water (controle) en b) een uM ligand-lytische peptide.

Figuur 7. E. coli kolonies op platen (10 ^-4 verdunning): a) behandeld met water (controle), b) behandeld met 1 uM ligand-lytische peptide, c), behandeld met 1 uM lytische peptide.

Discussie

Ligand-lytische peptiden zijn met succes gebruikt om effectief te richten en te vernietigen kankercellen (Hans en Leuschner 2004, Hansel et al. 2007).. Op basis van dit concept, ontwikkelden we een heptapeptide ligand dat bindt aan het oppervlak van protozoa in de darm van de Formosan ondergrondse termieten en gekoppeld aan een lytische peptide met het doel om deze obligate cellulose verterende symbionten in de darmen van termieten te vernietigen termieten te bereiken controle (Husseneder en Collier 2009).

...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2
EDANS	Novabiochem, EMD Millipore
Anaerobe handschoenenvat	Coy Laboratories, Inc.	Maatwerk
Intellus omgevingsregelaar	Percival Scientific, Inc.	I36NL
PC-10 glazen micropipet-trekker	Narishige International	PC-10
Glazen naalden (Model GD-1, 1 X 900 mm)	Narishige International	GD-1
Leitz micromanipulatoren	Vermont Optechs, Inc.	ACS01
Micro-injector	Tritech Research, Inc.	MINJ-1
Microcaps	Drummond Scientific	1-000-0005
LEICA fluorescentie-beeldvormingssysteem	Leica Microsystems	DMRxA2
LEICA dissectiescoop	Leica Microsystems	MZ16
LEICA microscoop	Leica Microsystems	DMLB
Olympus dissectiescoop	Olympus Corporation	SZ61