Macromoleculaire de handel tussen de plantencellen kan worden beoordeeld door kortstondig te drukken een fluorescent-gelabeld eiwit van belang en de analyse van de intra-en intercellulaire distributie door confocale microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een cel-cel Macromoleculaire Transport Assay In Planta Door gebruik te maken biolistische Bombardement
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier presenteren wij een eenvoudige en snelle protocol op te sporen en te beoordelen van de mate van cel-cel macromoleculaire transport in planta. In dit protocol is een fluorescent gelabeld eiwit van belang tijdelijk, uitgedrukt in plantenweefsel na biolistische levering van haar coderend DNA te construeren. De intra-en intercellulaire verdeling van de gelabelde eiwit wordt vervolgens geanalyseerd door confocale microscopie. We beschrijven deze technologie in detail, het verstrekken van stap-voor-stap protocollen test en evaluatie van de mate van symplastic eiwit transport in drie plantensoorten, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana en N. tabacum (tabak).
Protocol
Achtergrond
Symplastic transport van macromoleculen door de plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata, is van belang voor veel plant-pathologen en biologen. Bijvoorbeeld, zijn verschillende virale eiwitten waarvan bekend is dat plasmodesmal size exclusion grenzen te reguleren, zodat virale beweging 1-3. Ook zijn sommige endogene proteïnen, waaronder belangrijke ontwikkeling toezichthouders, aangenomen om van cel naar cel, vermoedelijk door plasmodesmata, tot niet-cel-autonoom 4-functie. Dus een betrouwbare methode te identificeren en te visualiseren macromoleculaire vervoer tussen plantencellen is veel vraag....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De sleutel voor het succes van de symplastic transport-test is het verkrijgen van een hoge efficiëntie van de omzetting, die de productie van statistisch significante en gemakkelijk waarneembaar signaal clusters mogelijk maakt. Dit kan worden bereikt met behulp van de bladeren geoogst van gezonde, robuuste planten, en het voorbereiden van gouddeeltjes bekleed met een zuivere en geconcentreerde DNA voorbereiding.
Met behulp van de bladeren in dezelfde groeifase is ook van vitaal belang voor d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Ons werk wordt ondersteund door subsidies van NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA, en BARD naar VC.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Goudmicrodeeltjes, 1,0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Goudmicrodeeltjes, 0,6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel-slangen | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios cartridge-voorbereidingsstation | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Slangen-snijder | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Heliumgasregelaar | Bio-Rad | 165-2413 |
Referenties
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
