Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse

Summary

We presenteren een procedure waarbij twee-dimensionale agarose-gel analyse kan worden gebruikt om de structuur van de replicatie tussenproducten die optreden na UV-straling te identificeren.

Abstract

Onnauwkeurige replicatie in de aanwezigheid van DNA-schade is verantwoordelijk voor het merendeel van de cellulaire herschikkingen en mutagenese waargenomen in alle celtypes en wordt algemeen aangenomen dat direct geassocieerd met de ontwikkeling van kanker bij de mens. DNA-schade, zoals die veroorzaakt door UV-straling, vermindert sterk het vermogen van replicatie naar de genomische template nauwkeurig te dupliceren. Een aantal van gen-producten zijn geïdentificeerd die nodig zijn voor het replicatie ontmoetingen DNA laesies in de sjabloon. Er is echter een resterende uitdaging is hoe deze eiwitten te bepalen laesies tijdens replicatie

Protocol

1. Groei en UV-straling.

1. 200μl van een verse 's nachts de cultuur die het plasmide pBR322 gekweekt in Davis medium ¹ aangevuld met 0,4% glucose, 0,2% casamino zuren, en 10 ug / ml thymine (DGCthy medium) en 100 ug / ml ampicilline is gekorreld. De cel pellet wordt vervolgens geresuspendeerd in 200μl DGCthy medium zonder ampicilline en wordt gebruikt om 20 ml DGCthy medium enten.
2. Culturen zijn geteeld zonder ampicilline selectie in een incubator schudden bij 37 ° C tot een OD ₆₀₀ van 0,5 (~ 5 x 10 ⁸ cellen / ml). Groei zonder ampicilline vermijdt selectie tegen abnormaal of onproductieve replicatie tussenproduc....

Discussion

Typische resultaten van wild-type cellen in de aanwezigheid en afwezigheid van UV-geïnduceerde schade zijn weergegeven in figuur 1. Bij het ontbreken van schade, kan ~ 1% van de totale plasmide DNA te vinden in de Y-boog wanneer de cellen groeien snel in exponentiële fase. Na de bestraling, is een tijdelijke toename van Y-vormige moleculen waargenomen als geblokkeerd replicatie vorken zich ophopen aan beschadigd sites. De X-vormige replicatie tussenproducten ook tijdelijk ophopen en blijven bestaan ​​totdat er een momen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
An example of the Southern analysis of the 2D gel probed	GE Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
15 μwatt germicidal lamp	Sylvania	F20T12/GO	UV Lamp
Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm	Daigger	EF28195T	UVC photometer
0.025 μm pore disks	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	Floating dialysis disks
PvuII	Fermentas	ER0632	Restriction Endonuclease
Nick-translation kit	Roche Group	976776	To make 32P-labeled probe
Blotting Paper	Whatman, GE Healthcare	3030-704	For Southern transfer
Nylon membrane	GE Healthcare	RPN203S	For Southern transfer