We presenteren een procedure waarbij twee-dimensionale agarose-gel analyse kan worden gebruikt om de structuur van de replicatie tussenproducten die optreden na UV-straling te identificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Onnauwkeurige replicatie in de aanwezigheid van DNA-schade is verantwoordelijk voor het merendeel van de cellulaire herschikkingen en mutagenese waargenomen in alle celtypes en wordt algemeen aangenomen dat direct geassocieerd met de ontwikkeling van kanker bij de mens. DNA-schade, zoals die veroorzaakt door UV-straling, vermindert sterk het vermogen van replicatie naar de genomische template nauwkeurig te dupliceren. Een aantal van gen-producten zijn geïdentificeerd die nodig zijn voor het replicatie ontmoetingen DNA laesies in de sjabloon. Er is echter een resterende uitdaging is hoe deze eiwitten te bepalen laesies tijdens replicatie
Protocol
1. Groei en UV-straling.
- 200μl van een verse 's nachts de cultuur die het plasmide pBR322 gekweekt in Davis medium 1 aangevuld met 0,4% glucose, 0,2% casamino zuren, en 10 ug / ml thymine (DGCthy medium) en 100 ug / ml ampicilline is gekorreld. De cel pellet wordt vervolgens geresuspendeerd in 200μl DGCthy medium zonder ampicilline en wordt gebruikt om 20 ml DGCthy medium enten.
- Culturen zijn geteeld zonder ampicilline selectie in een incubator schudden bij 37 ° C tot een OD 600 van 0,5 (~ 5 x 10 8 cellen / ml). Groei zonder ampicilline vermijdt selectie tegen abnormaal of onproductieve replicatie tussenproducten ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Typische resultaten van wild-type cellen in de aanwezigheid en afwezigheid van UV-geïnduceerde schade zijn weergegeven in figuur 1. Bij het ontbreken van schade, kan ~ 1% van de totale plasmide DNA te vinden in de Y-boog wanneer de cellen groeien snel in exponentiële fase. Na de bestraling, is een tijdelijke toename van Y-vormige moleculen waargenomen als geblokkeerd replicatie vorken zich ophopen aan beschadigd sites. De X-vormige replicatie tussenproducten ook tijdelijk ophopen en blijven bestaan totdat er een momen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Werken in ons lab wordt ondersteund door LOOPBAAN award MCB0551798 van de National Science Foundation en het gebied te verlenen R15GM86839 van de NIGMS-NIH.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Een voorbeeld van de Southern-analyse van de gehybrideerde 2D-gel | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt kiemdodende lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV-lamp |
| Blak-Ray UV-intensiteitsmeter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC-fotometer |
| 0,025 μm poriediscs | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Drijvende dialysediscs |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restrictie-endonuclease |
| Nick-translatiekit | Roche Group | 976776 | Voor het maken van 32P-gelabelde probes |
| Blotpapier | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | Voor Southern-transfer |
| Nylonmembraan | GE Healthcare | RPN203S | Voor Southern-transfer |
Referenties
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regres....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
