Het testen van β-amyloïde toxiciteit met behulp van een transgene C. elegans Model

Samenvatting

De intens bestudeerde nematode worm Caenorhabditis elegans Kan transgenically worden gemanipuleerd om het menselijk β-amyloïd peptide (Aß) uit te drukken. Geïnduceerde expressie van Aß in C. elegans Spier leidt tot een snelle, reproduceerbare verlamming fenotype die gebruikt kan worden om behandelingen die Aß toxiciteit moduleren volgen.

Samenvatting

Accumulatie van het β-amyloïd peptide (Aß) wordt algemeen aangenomen dat centraal staan ​​in de inductie van de ziekte van Alzheimer, maar de relevante mechanisme (s) van de toxiciteit zijn nog onduidelijk. Aß is ook intramusculair gestort in Inclusion Body Myositis, een ernstige menselijke myopathie. De intens bestudeerde nematode worm Caenorhabditis elegans kan transgenically worden gemanipuleerd om de menselijke Aß uit te drukken. Afhankelijk van het weefsel of het tijdstip van Aß expressie, kunnen transgene wormen hebben gemakkelijk meetbaar fenotypen die dienen als een read-out van Aß toxiciteit. Bijvoorbeeld, transgene wormen met pan-Aß neuronale expressie gebreken vertonen is associatief leren (Dosanjh et al., 2009.), Terwijl transgene wormen met constitutieve spier-specifieke expressie vertonen een progressieve, leeftijd-afhankelijke verlamming fenotype (Link, 1995; Cohen et al. . 2006). Een bijzonder nuttige C. elegans model maakt gebruik van een temperatuurgevoelige mutatie in het mRNA surveillance systeem engineer temperatuur-induceerbare spieren de expressie van een transgen Aß, wat resulteert in een reproduceerbare verlamming fenotype af van de temperatuur opschakelen (Link et al.. 2003). Behandelingen die tegen Aß toxiciteit in dit model [bijv., expressie van een beschermende transgen (Hassan et al.. 2009) of blootstelling aan Ginkgo biloba extracten (Wu et al.. 2006)] reproduceerbaar de snelheid van verlamming veroorzaakt door de temperatuur opschakelen van deze transgene veranderen wormen. Hier beschrijven we ons protocol voor het meten van de snelheid van verlamming in deze transgene C. elegans model, met bijzondere aandacht voor experimentele variabelen die deze meting kunnen beïnvloeden.

Protocol

1) voorbereiden Nematode Groei Media platen voor verlamming test.

Verlamming testen worden uitgevoerd op de standaard Nematode Growth Media (NGM) platen routinematig gebruikt voor C. elegans voortplanting en genetica (Stiernagle, 2006).

1. Autoclaaf de NGM oplossing die NaCl, Agar en Peptone in een erlenmeyer en voeg de juiste hoeveelheid steriel CaCl _2, Uracil, Cholesterol, 1M MgSO ₄ en 1M KPO _4. Aliquot 10 ml vloeistof NGM in elke 60 mm x 15 mm Petri Dish. Laat NGM een nacht stollen op kamertemperatuur.
2. Als het testen voor de effecten van verbindingen / extracten, aliquot het extract op elk bord en gebruik een strooier gelijkmatig te verdelen het extract over het oppervlak van de plaat. Laat extract een nacht drogen bij kamertemperatuur. Groter dan 1 ml zal meer tijd nodig om te drogen.
3. Spot elk bord met 250 ul van E. coli-stam OP5O gekweekt in LB Media 's nachts voor een optische dichtheid van 0.4-0.6. Laat bacteriën een nacht drogen bij kamertemperatuur.

Relevante variabelen

De leeftijd van de platen heeft een significante invloed op de verlamming assay, zoals oudere platen hebben de neiging uit te drogen. Gebruik platen gegoten binnen een week van verlamming test. Voor optimale resultaten, giet platen 3-4 dagen voor het begin van synchrone worm bevolking [zie (2) hieronder]. Voor een experiment, gebruik dan alleen platen gegoten uit dezelfde partij.

Het veranderen van de grootte van het gazon (dat wil zeggen gespot vs verspreid) en / of de aard van de bacterie zal ook veranderen het gedrag van de wormen. Verlamming testen kunnen worden uitgevoerd met behulp van alternatieve E. coli-stammen als een bron van voedsel (bijvoorbeeld de HT115 gebruikte stam in het voeden van RNAi experimenten), maar dit kan veranderen de kinetiek van verlamming, waardoor het nodig passende interne controles.

2) Voorbereiding van Age-synchroon Worm Populaties

Strain CL4176 (SMG-1 (cc546 ^ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aß minigen + rol-6 (su1006) marker-gen] X wordt het meest gebruikt voor het testen van Aß-geïnduceerde verlamming deze soort en andere transgene modellen zijn beschikbaar. academische onderzoekers voor een nominale vergoeding uit het Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. Aan de leeftijd synchronie van de test bevolking verdient het de voorkeur om te beginnen met een gesynchroniseerde ouderlijk generatie te maximaliseren. Een week voor de inleiding van de verlamming test van de test bevolking, gebruik dan een platina worm picker tot 20-30 zwangere volwassenen overdracht naar een aantal 10 cm NGM borden verspreid met OP50 voor een 2 uur durende ei te leggen bij 16 ° C (de permissieve temperatuur voor CL4176 ). Verwijder de zwangere volwassenen en laat het nageslacht te groeien gedurende 7 dagen, tegen die tijd zullen zij 'tweede dag' zwangere volwassenen.
2. (Dag 1) De tweede dag zwangere volwassenen gebruikt om de leeftijd-synchrone testen bevolking voor te bereiden. Voor elke experimentele conditie van het object is het genereren van drievoud platen met 50 tot 75 jaar-synchroon wormen. Met behulp van een platina-worm Picker, overdracht 10-12 van de dag 2 zwangere volwassenen op 60 mm (10 ml volume) NGM platen gespot met OP50. Laat de wormen om eieren te leggen bij 16 ° C gedurende 2 uur, kies dan uit de volwassenen en laat de eieren uit te komen en te groeien bij 16 ° C. Op dit punt is het het beste om iemand die niet in het scoren van de platen om ze code, zodat de teller zal blind zijn voor experimentele omstandigheden.

Relevante variabelen

Het stadium van de embryonale ontwikkeling bij het eieren gelegd (~ de 26-cellig stadium voor het wildtype wormen onder optimale condities) is een functie van de volwassen leeftijd en voeding. Als de zwangere volwassenen worden gebruikt voor de voorbereiding van de test bevolking ouder zijn of uitgehongerd, zal later stadium eieren worden gelegd, waardoor de leeftijd synchronie van de bevolking en de reproduceerbaarheid van verlamming kinetiek. Het is essentieel dan de mono-Axenische (dat wil zeggen, alleen OP50 bacteriën) culturen worden gebruikt (microbiële verontreinigingen kan ernstige gevolgen hebben voor deze test), en de reproduceerbaarheid is het hoogst als het drievoud platen hebben vergelijkbare aantallen wormen.

3) Transgene Inductie en verlamming Assay

1. (Dag 3) Upshift platen tot 25 ° C 48 uur na het einde van de synchrone ei te leggen, wormen moet worden bij het derde larvale stadium (L3). De platen moeten worden geregeld, zonder stapelen in een 25 ° C incubator om alle platen tot 25 ° C te bereiken op hetzelfde moment.
2. (Dag 4) Begin met het scoren van de verlamming van de wormen (stam CL4176) bij 18-20 uur na de start van opschakelen. Op dit moment moeten alle wormen in de bevolking hebben bereikt de vierde larvale (L4) stadium. Blijven scoren in twee uur stappen totdat alle wormen op elk van de platen zijn verlamd. Om onbekende redenen, verlamming is nog niet eens over de lichaamslengte: het hoofd regio is het laatste deel van de worm te stoppen bewegen. Zo, wORMS die onlangs zijn begonnen met verlamming niet kunnen vertalen over de plaat, maar kan bewegen hun hoofd, waardoor bacteriën opruimen rond hun voorste en het verlaten van een "halo" van verwijderd bacteriën. Deze wormen zullen altijd worden volledig verlamd, en dus wormen met halo's worden gecategoriseerd als verlamd. Sommige wormen hebben geen halo's, maar zal ook niet zien spontane beweging, deze zijn getest door porren met de worm picker. Als er een aangespoord worm kan een full body golfvoortplanting niet ondergaan op porren, wordt het ook gescoord als verlamd. Voor een efficiënte scoren, is het het gemakkelijkst om de verlamde wormen verplaatsen naar een onbevlekt sector van de plaat, zodat ze niet onbedoeld worden rescored de komende periode scoren. (Dit maakt het ook mis-gecategoriseerd wormen aan te tonen beweging, waardoor een scoring correctie).
3. Voor het genereren van een verlamming curve, op elk tijdstip van de fractie van de wormen op elke plaat die nog niet zijn verlamd wordt omgezet in een percentage, en de gemiddelde "unparalyzed" percentage is uitgezet tegen de tijd van opschakelen initiatie. (De reden voor het plotten van op deze manier is dat de resulterende curve is formeel analoog aan een survival curve, en dus kan worden geanalyseerd met behulp van standaard niet-parametrische survival statistieken.)

Relevante variabelen

Het opschakelen van transgene myo-3/Aβ wormen moet gebeuren voordat ze in het midden van de L4 stadium voor verlamming te worden gestart, omdat de myo-3 promotor is op ontwikkelingsgebied geregeld, en heeft aanzienlijk verminderd uitdrukking in de late L4 of volwassen wormen. Op dezelfde manier wordt de expressie van deze transgene geblokkeerd als wormen worden uitgehongerd, dus het is essentieel dat de wormen zijn goed doorvoed gedurende het experiment. We hebben nog nooit waargenomen een verlamde worm te herstellen onder alle omstandigheden, en na 12 tot 16 uur van opschakelen, alle CL4176 wormen zullen verlammen, zelfs als ze schakelde terug tot 16 ° C. In stam CL4176, om voldoende opregulatie van transgenexpressie leiden tot verlamming kan optreden bij lagere temperaturen (dat wil zeggen, 20-25 ° C), hoewel de timing van verlamming zal worden gewijzigd. De verlamming is afhankelijk van de specifieke gebruikte transgene stam (we hebben gebouwd myo-3/Aβ stammen met zowel sneller als langzamer dan de CL4176), dus met alternatieve stammen de scorende venster moet mogelijk worden aangepast.

4) representatieve resultaten

Weergegeven in figuur 1 is een plot van een verlamming curve voor CL4176, zowel onbehandeld en blootgesteld aan 6,27 mM cafeïne (uiteindelijke concentratie in NGM plaat). Deze behandeling resulteert in een statistisch zeer significante vertraging in de verlamming van ongeveer 4 uur, die we als een indicatie van de onderdrukking van Aß toxiciteit interpreteren in dit model. Weergegeven in figuur 2 is een onafhankelijk experiment testen van de effecten van cafestol, een andere verbinding die in koffie. Dit perceel is typisch voor behandelingen die niet invloed Aß toxiciteit. Merk op dat in beide experimenten ongeveer de helft van de onbehandelde CL4176 populaties verlamd na 24 uur, en de verlamming is compleet met 28 uur. Deze termijnen zijn typisch voor de verlamming van controle CL4176 populaties. Significante afwijkingen van deze timing zijn indicatief van veranderde omgevingscondities of spontane verwijdering van transgene exemplaren. (CL4176 bevat een chromosomaal geïntegreerd transgene array met meerdere exemplaren van de myo-3/Aβ transgen. Hoewel deze transgene array is normaal gesproken behoorlijk stabiel, elke verspreiding van de stam bij temperaturen> 16 ° C zal kiezen voor zeldzame wormen die hebben ondergaan een spontane verwijdering van transgenen, wat resulteert in varianten die een geringere Aß expressie en langzamer verlamming resultaten.)

Figuur 1. Verlamming curve voor stam CL4176 wormen onbehandeld of worden blootgesteld aan 6,27 mM cafeïne (Sigma). De aangegeven tijden zijn vanaf de start van de temperatuur opschakelen. Foutbalken = SEM

Figuur 2. Verlamming curve voor CL4176 wormen worden blootgesteld aan 0,48 mM cafestol (Sigma). Foutbalken = SEM

Discussie

Het protocol hebben we beschreven kan effectief worden gebruikt voor het testen van de effecten van de verbindingen op Aß toxiciteit. Gepubliceerd voorbeelden zijn de effecten van Ginkgo biloba-extract bestanddelen (Wu et al.. 2006) en reserpine (Arya et al.. 2009). Verbindingen die zijn beschermend tegen Aß toxiciteit bij andere systemen hebben ook aangetoond dat beschermende in dit model (bijv. memantine, onze niet-gepubliceerde resultaten). Een belangrijke reden voor de oprichting van dit model is dat de goed ontwikkelde genetische en moleculaire technieken beschikbaar zijn in C. elegans kan worden gebruikt om mechanismen van Aß toxiciteit te onderzoeken. Zo kunnen de effecten specifieke mutaties op de Aß toxiciteit worden getest (bv. een vermindering van de insuline-achtige signalering door de invoering van een daf-2 verlies-van-functie mutatie, Florez-McClure et al. 2007)., En dit model kan ook worden gebruikt om de effecten van de over-expressie transgenen (Fonte et al.. 2008) te onderzoeken. We hebben onlangs uitvoerig gebruik gemaakt van dit model om de effecten op toxiciteit van enkel aminozuur substituties in Aß (niet gepubliceerde data) te onderzoeken.

De transgene model hier beschreven analyses het effect van acute Aß expressie op spiercel functie. Op het moment van verlamming spiercellen en hun sarcomeer zijn intact, de verlamming fenotype is niet het gevolg van spier celdood. Echter, na verlamming (~ 48 uur na de eerste opschakelen) is er een afbraak van spieren integriteit en de uiteindelijke dood van de wormen. We hebben niet onderzocht die stroomafwaarts effect van Aß meningsuiting of gebruikten het als een toxiciteit marker.

De induceerbare Aß uitdrukking hier beschreven model is niet geschikt voor het onderzoeken van behandelingen die β-amyloïde formatie per se moduleren. Hoewel de transgene wormen met constitutieve Aß uitdrukking vorm gemakkelijk detecteerbaar amyloïd afzettingen (Fay et al., 1998;.. Link et al. 2001), transgene wormen met induceerbare Aß uitdrukking hebben zelden amyloid deposito's en de verlamming fenotype verschijnt onafhankelijk van amyloid depositie (Drake et al.. 2003). Onze resultaten komen overeen met de opvatting dat acute toxiciteit van Aß geïnduceerde expressie het gevolg van de accumulatie van oplosbare Aß oligomere, niet amyloïde afzetting.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia	Quantity/2L	Bedrijf / Catalogus #	Reacties
NaCl	6g	Sigma-Aldrich / S9888
Agar-agar	40g	Sigma-Aldrich / A7002
Pepton	5g	Sigma-Aldrich / P0556
DDH 2 O	2L
1M CaCl 2	2 ml		147.02mg/mL in DDH 2 O
Uracil	2 ml		2mg/mL in DDH 2 O
Cholesterol	2 ml		5mg/ml in ethanol (niet autoclaaf)
1M MgSO 4	2 ml		246.5mg/mL in DDH 2 O
1M KPO 4	50ml		98mg KH 2 PO 4. ML, 48mg K2HPO4/mL in DDH 2 O, pH
Erlenmeyer		VWR