In vivo Near Infrared Fluorescentie (NIRF) Intravasculaire Moleculaire Beeldvorming van Inflammatoire Plaque, een multimodale aanpak Imaging Atherosclerose

Samenvatting

We detail een nieuw nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) katheter voor twee-dimensionale intravasculaire moleculaire beeldvorming van plaque biologie In vivo. De NIRF katheter kan visualiseren de belangrijkste biologische processen, zoals een ontsteking van rapportage over de aanwezigheid van plaque-activeerbare enthousiaste en doelgerichte NIR fluorochromen. De katheter maakt gebruik van klinische techniek en power-eisen en is bedoeld voor toepassing in de menselijke kransslagaders. De volgende onderzoeksvragen studie beschrijft een multimodale beeldvorming strategie die gebruik maakt van een roman In vivo Intravasculaire katheter NIRF om beeld en te kwantificeren inflammatoire plaque in de proteolytisch actieve ontstoken konijn atheromata.

Samenvatting

De vasculaire respons op letsel is een goed gecoördineerde ontstekingsreactie die wordt getriggerd door de accumulatie van macrofagen in de vaatwand, wat leidt tot een ophoping van lipidrijke intraluminale plaque, proliferatie van gladde spiercellen en een progressieve vernauwing van het vaatlumen. De vorming van dergelijke kwetsbare plaques die gevoelig zijn voor ruptuur vormt de basis voor de meeste gevallen van acuut myocardinfarct. De complexe moleculaire en cellulaire ontstekingscascade wordt aangestuurd door de rekrutering van T-lymfocyten en macrofagen en hun paracriene effecten op endotheelcellen en gladde spiercellen.¹

Moleculaire beeldvorming bij atherosclerose is uitgegroeid tot een belangrijk klinisch en onderzoeksinstrument dat in vivo visualisatie van inflammatie en andere biologische processen mogelijk maakt. Verschillende recente voorbeelden tonen het vermogen aan om plaques met een hoog risico bij patiënten te detecteren en de effecten van farmacotherapeutica bij atherosclerose te beoordelen.⁴ Hoewel een aantal moleculaire beeldvormingsbenaderingen (met name MRI en PET) biologische aspecten van grote vaten zoals de halsslagaders in beeld kunnen brengen, zijn er weinig opties voor de beeldvorming van kransslagaders.² De komst van optische beeldvormingsstrategieën met een hoge resolutie, in het bijzonder nabij-infrarood fluorescentie (NIRF), in combinatie met activeerbare fluorescente probes, heeft de gevoeligheid verhoogd en geleid tot de ontwikkeling van nieuwe intravasculaire strategieën om de biologische beeldvorming van humane coronaire atherosclerose te verbeteren.

Moleculaire beeldvorming met nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) maakt gebruik van excitatielicht met een gedefinieerde bandbreedte (650-900 nm) als fotonbron die, wanneer toegedragen aan een optisch contrastmiddel of een fluorescente probe, fluorescentie uitzendt in het NIR-venster; dit kan worden gedetecteerd met een geschikt emissiefilter en een camera met een gevoelige charge-coupled device. In tegenstelling tot zichtbaar licht dringt NIR-licht diep door in weefsel, wordt het aanzienlijk minder verzwakt door endogene fotonabsorbers zoals hemoglobine, lipiden en water, en maakt het hoge target-to-background-ratio's mogelijk vanwege verminderde autofluorescentie in het NIR-venster. Beeldvorming binnen het NIR-'venster' kan het potentieel voor in vivo beeldvorming aanzienlijk verbeteren.^2,5

Inflammatoire cysteïneproteasen zijn uitgebreid bestudeerd met behulp van activeerbare NIRF-probes¹⁰ en spelen een belangrijke rol bij atherogenese. Via degradatie van de extracellulaire matrix dragen cysteïneproteasen significant bij aan de progressie en complicaties van atherosclerose⁸. In het bijzonder is de cysteïneprotease cathepsine B sterk tot expressie gebracht en colokaliseert deze met macrofagen in experimentele muizen-, konijn- en menselijke atheromen.^3,6,7 Bovendien kan de activiteit van cathepsine B in plaques in vivo worden gedetecteerd met behulp van een eerder beschreven 1-D intravasculaire nabij-infrarood fluorescentietechnologie⁶, in combinatie met een injecteerbaar nanosensor-agens bestaande uit een polylysine-polymeerbackbone gederivatiseerd met meerdere NIR-fluorochromen (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) dat resulteert in sterke intramoleculaire quenching bij de basislijn.¹⁰ Na gerichte enzymatische splitsing door cysteïneproteasen zoals cathepsine B ( waarvan bekend is dat ze colokaliseren met plaque-macrofagen) scheiden de fluorochromen zich, wat resulteert in een aanzienlijke amplificatie van het NIRF-signaal. Intravasculaire detectie van het NIR-fluorescentiesignaal door de gebruikte nieuwe 2D intravasculaire NIRF-katheter maakt nu hoge resolutie, geometrisch nauwkeurige in vivo detectie van cathepsine B-activiteit in ontstoken plaques mogelijk.

In vivo moleculaire beeldvorming van atherosclerose met behulp van kathetergebaseerde 2D NIRF-beeldvorming, in tegenstelling tot een eerdere 1D-spectroscopische benadering,⁶ is een nieuw en veelbelovend instrument dat gebruikmaakt van verhoogde protease-activiteit in macrophage-rijke plaques om vasculaire ontsteking te detecteren.^11,12 Het volgende onderzoeksprotocol beschrijft het gebruik van een intravasculaire tweedimensionale NIRF-katheter om de plaque-structuur in beeld te brengen en te karakteriseren aan de hand van cruciale aspecten van de plaquebiologie. Het is een vertaalbaar platform dat, wanneer geïntegreerd met bestaande klinische beeldvormingstechnologieën zoals angiografie en intravasculaire echografie (IVUS), een unieke en nieuwe geïntegreerde multimodale moleculaire beeldvormingstechniek biedt die inflammatoire atheromen onderscheidt en de detectie van intravasculaire NIRF-signalen in menselijke kransslagaders mogelijk maakt.

Protocol

In vivo diermodel: generatie van experimentele AortoIliac Atherosclerose

1) Baseline Angiografie en Balloon ontbossing en erosie

1. Voorafgaand aan het verkrijgen baseline angiografie en ballon ontblooting, is een Nieuw-Zeelandse wit konijn gevoed met een hoog cholesterolgehalte (1%) dieet voor 1 week. Dit dier is gebruikt voor translationeel relevantie als 1) het aorto-iliacs schepen in konijnen zijn hetzelfde kaliber als de menselijke kransslagaders (2.5-3.5mm) en 2) de hyperlipidemie, ballon-letsel model genereert ontstoken atherosclerose met soortgelijke ontstekingscellen (macrofagen ) en moleculen (cathepsinen) als in de menselijke atherosclerose.
2. Naar aanleiding van cholesterol voeding, het dier is verdoofd met propofol en ketamine. Een one-inch ventrale middellijn nek incisie wordt gemaakt met behulp van met behulp van een groot 15-scalpel. Met behulp van stompe dissectie technieken, is de spieren onder de fascia aan de rechterkant van de luchtpijp blootgesteld. De linker sternocephalicus spier is gescheiden langs de bindweefsel knooppunt, en de juiste gemeenschappelijke halsslagader wordt blootgesteld. De slagader is gescheiden van de nervus vagus. Proximale en distale hechtdraad lussen worden geplaatst op de slagader, zodat voor het terugtrekken en occlusie. A 1 tot 2 mm afgeschuinde arteriotomie wordt gemaakt waardoor een vijf Franse (buitendiameter 1.67mm) vasculaire schede wordt ingebracht en heparine (1000μ/mL, ~ 150units/kg) is intra-arterieel toegediend via de schede.
3. Contrastvloeistof (Ultravist) wordt vervolgens geïnjecteerd (1 tot 2 ml) over een periode van 2 seconden tot een controle angiogram van de distale aorta en beide iliacale slagaders te verkrijgen.
4. De iliofemoral slagaders en de aorta worden dan gewond raken door endotheliale denudatie. Met behulp van standaard methoden fluoroscopie, is een 3FR Fogarty embolectomie catheter geplaatst in het distale iliofemoral slagader en opgeblazen met 0,3 tot 0,5 cc van het contrast (50% contrast/50% zoutoplossing) of lucht. De katheter wordt dan proximaal teruggetrokken in zijn opgeblazen toestand een afstand langs de rechter iliacale en distale aorta tot aan de take-off van de linker nierslagader. Naar aanleiding van de ballon denudatie, is angiografie herhaald om vat doorgankelijkheid document. Na de angiografie, alle katheters en scheden zijn verwijderd en de proximale juiste gemeenschappelijke halsslagader wordt geligeerd, worden de spieren en fascia gehecht met een 4 / 0 resorbeerbaar garen, en de huid incisie gesloten met een 4 / 0 niet-resorbeerbare hechtdraad.
5. Het dier is dan toegestaan ​​om te herstellen met de toediening van een dosis antibiotica (Cephazolin, 0,5 gram IM). Pijnstillers, inclusief 0,01 mg / kg buprenorfine IM (twee maal per dag als nodig). Dieren worden vervolgens voortgezet op 1% cholesterol gedurende 4 weken na de ballon denudatie. In week 5, zijn dieren overgebracht naar 0,3% cholesterol dieet.

Geïntegreerde multi-modale beeldvorming van Rabbit Atheromata

2) Labeling van proteolytisch actieve ontstoken plaque met behulp van injecteerbare nanosensor, angiografie, intravasculaire ultrasound (IVUS), en in vivo intravasculaire NIRF beeldvorming van Rabbit atheroma

1. Acht weken na de ballon letsel en 24 uur voor beeldvorming, is het konijn geïnjecteerd met intraveneuze 500 nmol / kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) via het oor ader.
2. Vierentwintig uur na de injectie, de dieren worden verdoofd en arteriële toegang wordt verkregen via links gemeenschappelijke halsslagader (zie stap 1.2). Intra-arteriële heparine wordt toegediend (150 eenheden / kg). Baseline angiografie wordt verkregen als hierboven.
3. Een IVUS catheter is geladen op een klinische kransslagader in staat is 0.014 inch draad en ingebracht in de schede. Met behulp van fluoroscopie, is de radiopake tip van de draad distaal gepositioneerd in de rechter bekkenslagader. De IVUS katheter wordt vervolgens gevorderd in het proximale bekkenslagader met behulp van een standaard klinische monorail techniek.
4. Een 100 mm pullback is geïnitieerd en beelden worden vastgelegd. Longitudinale reconstructie van het schip wordt verkregen en luminale plaque is geïdentificeerd.
5. De NIRF katheter ^11,12 is geladen op de 0,014 inch draad (monorail systeem), en de katheter wordt zorgvuldig ingebracht in de schede en belichtingskop is distaal gepositioneerd in de juiste iliacale slagader.
6. Meerdere geautomatiseerde pullbacks (1 mm / sec lengterichting pullback, 30 rondes per minuut) worden uitgevoerd en fluorescentie signalen binnen de zones van atherosclerose worden genoteerd. De beelden worden opgenomen en de verdere verwerking met de juiste schaal en windowing afhankelijk van het bereik van het signaal is bereikt.

3) Euthanasie en isolatie van ex vivo aorto-iliacale weefsel

1. Euthanasie is bereikt met 1cc van euthanasie agent (oplossing van 390mg natrium-pentobarbital en 50 mg fenytoïne natrium), intraveneuze, enkele injectie.
2. De arteriële boom is geperfuseerd met 0,9% fysiologische zoutoplossing tot de vena cava inferior is vrij van bloed. De atherosclerotische aorta en de slagaders zijn geïdentificeerd en vrij gesneden uit de omliggende weefsels. Bovendien hebben kleine 2 x 2 cm stukjes liver-, nier-, milt en het hart worden ook verkregen.
3. Ex vivo NIRF beeldvorming met de intravasculaire NIRF beeldvorming catheter kan worden gedaan in dit stadium. Het schip is langwerpig en de NIRF katheter is opnieuw ingevoegd in proximale aorta totdat de belichtingskop is gepositioneerd op de juiste bekkenslagader of bifurcatie. Meerdere geautomatiseerde pullbacks worden uitgevoerd zoals hierboven (zie 2.6).

4) Ex vivo Fluorescentie reflectie Imaging (vrij) van ontleed aorta en de slagaders

1. Ontleed weefsel wordt geplaatst in 10-20 cc fysiologische zoutoplossing en vervoerd voor vrij analyses (Kodak Image Station 4000mm Pro, Carestream Health, Inc.)
2. Aorta, iliacale schepen zijn verlengd te benaderen real-time lengtes en beelden worden verkregen bij verschillende golflengten [wit licht, groen fluorescent kanaal (ex 495 nm, 515 nm em), Cy5 (ex-565 nm, 670 nm em) en Cy7 (ex 650 nm, 760 nm em)] kanalen. Een reeks van de blootstelling tijden worden gebruikt voor elke golflengte (0,1-30sec) en verworven afbeeldingen worden geëxporteerd als DICOM of 16-bit ongeschaald TIFF-bestanden voor verdere analyse. Als positieve en negatieve controles, zijn organen (lever, milt, nieren en hart) afgebeeld op vergelijkbare kanalen en belichtingstijden.
3. Gebieden van verhoogde signaal in het nabij-infrarode kanaal (780nm +) worden vermeld in atherosclerotische bloedvaten.

5) Tissue Inbedding voor het snijden en immunohistochemische analyse

1. Gebieden van normale (niet-beschadigde weefsel, dat wil zeggen links bekkenslagader) en gebieden van de plaque worden geïdentificeerd en kleine 5-10 mm ringen van het weefsel zijn ingebed in OCT (Optimal Cutting Temperature) media. Blokken worden opgeslagen bij -80 C tot snijden.
2. Standaard technieken voor het snijden en immunohistochemische analyses worden uitgevoerd. Hematoxyline en eosine kleuring, Ram-11 en Cathepsine B vlekken worden uitgevoerd.

Analyses en integratie van multimodale beelden (angiografie, IVUS, NIRF en vrij)

6) Verwerking van NIRF en vrij beelden

1. DICOM-bestanden met beeldgegevens van NIRF en vrij (genomen op nabij-infrarood 780 nm kanaal) pullbacks worden verwerkt met behulp van MATLAB en Osirix software, respectievelijk. De juiste window tot een volledige reeks van het signaal intensiteit display is bereikt. Uiteindelijke beelden worden geëxporteerd als TIFF-bestanden.
2. Bestanden worden geïmporteerd in de standaard image processing software (Keynote kan worden gebruikt). Beelden worden afgestemd op basis van referentiepunten (dat wil zeggen wervels op angiogram, iliacale bifurcatie, en renale arterie). Gebieden van de normale schepen en plaque worden geïdentificeerd.
3. Regio's van interest (ROI) worden handmatig opgespoord (voor normaal weefsel en gebieden van plaque) en het gemiddelde signaal intensiteiten worden verkregen met behulp van Osirix en MATLAB respectievelijk, voor zowel vrij en NIRF beelden. Het begeleiden juiste tracing, is de longitudinale IVUS beeld van het vaartuig dat wordt gebruikt en de identificatie van de normale schip en plaque zijn gemakkelijk te herkennen.
4. Target-tot achtergrond (TBR) ratio's zijn berekend voor plaque zones.

Representatieve resultaten:

Na voltooiing van bovengenoemde protocol, kunnen we identificeren en karakteriseren gebied van augmented cathepsine protease activiteit bij inflammatoire plaque in de aorta en iliacale vaten. Injectie van een activeerbare nanosensor (Prosense/VM110) stelt ons in staat te identificeren proteolytisch actief plaque. Deze verschijnen als heldere of het signaal intense zones als beeld gebracht met behulp van vrij in het nabije infrarood kanaal (750 nm). De NIRF pullbacks correleren met een verhoogde signaal intensiteit met vrij en uitlijningen met IVUS die anatomische registratie van NIRF signalen mogelijk te maken. Berekend plaque TBR's verkregen uit Vrij en NIRF waren vergelijkbaar (zie figuur 3: de gemiddelde NIRF TBR 4,2, betekent vrij TBR 2.9). Immunohistochemische analyse van heldere plaque bevestigt intense aanwezigheid van RAM-11 en Cathepsine B-activiteit op het gebied van de plaque (gegevens niet getoond).

Figuur 1. Schematische weergave van 2D-NIRF katheter Om het klinisch potentieel van een 1D NIRF sensing benadering van ⁶ uit te breiden, bouwden we een nieuwe 2-D NIRF-katheter voor intravasculaire beeldvorming. ^11,12 De custom-built katheter bestaat uit een optische vezel (125 micron diameter gehuisvest in polyethyleen buis: 2.9F) dat verlicht met behulp van een 750 nm laser excitatie bron. Laserlicht wordt uitgezonden op een hoek van 90 graden ten opzichte van glasvezel-as. Het systeem maakt gebruik van twee geautomatiseerde motoren (rotatie en translatie) om gelijktijdig 360 graden beeldvorming en longitudinale pullback in staat te stellen ware 2D-beeldvorming te verkrijgen. Beelden worden gebruikt met toestemming van referentie 11.

Figuur 2. Schematische demonstreren protease-gemedieerde activering van de nanosensor, Prosense/VM110. Afbeelding gebruikt met toestemming van referentie 10.

Figuur 3. In vivo en ex vivo Plaque TBRs (target-tot achtergrond ratio's)

Discussie

Ontstoken hoog risico of kwetsbare plaques zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor het grootste deel van hartinfarcten. De identificatie van dergelijke plaques voorafgaand aan de aanvang van de symptomen heeft belangrijke klinische implicaties, zowel in het voorspellen van de resultaten en het begeleiden van medische therapie. Conventionele coronaire arteriële beeldvormende technieken, zoals x-ray angiografie meestal gericht op de karakterisering van luminaal vernauwingen in plaats van het verlichten van de onderligge...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Prosense 750	Visen Medical	VM110	500 nmol/kg IV-injectie
Natriumheparine	APP Pharmaceuticals	401586D
Cefazoline	NovaPlus	46015683
Lidocaïne HCl 2%	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01
Buprenorfine	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10
Ketamine	Hospira Inc.	NDC 0409-2051-05
Dieet met hoog cholesterolgehalte 1%	Research Diets	C30293
Dieet met hoog cholesterolgehalte 0.3%	Research Diets	C30255