Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Samenvatting

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound met S-Adenosyl- _L-Homocysteine-bindende als selectiviteit functie om methyl-isoleren van een Escherichia coli Hele cellysaat en identificeren hen door MS.

Samenvatting

Er is een verscheidenheid van benaderingen om de complexiteit van het proteoom te verminderen op basis van functionele kleine moleculen-eiwit interacties, zoals affiniteitschromatografie ^een of Activity Based Protein Profiling ^2. Trifunctionele Capture Compounds (CCS, figuur 1A) ^drie vormen de basis voor een generieke aanpak, waarbij de initiële evenwicht gedreven interactie tussen een klein molecuul sonde (de selectiviteit functie, hier _{S-adenosyl-L-homocysteine,} SAH, figuur 1A) en doeleiwitten is onomkeerbaar vast op foto-crosslinking tussen een onafhankelijke foto-activable reactiviteit functie (hier een phenylazide) van de CC en het oppervlak van het doel eiwitten. De sorteerfunctie (hier biotine) dient om de CC te isoleren - eiwit conjugaten van complexe biologische mengsels met behulp van een vaste fase (hier streptavidine magnetische korrels). Twee configuraties van de experimenten zijn mogelijk: "off-bead" ⁴ of de thans wordt beschreven "on-bead" configuratie (Figuur 1B). De selectiviteit functie kan vrijwel elke kleine molecule van belang (substraten, remmers, medicijn-moleculen) zijn.

_{S-adenosyl-L-methionine} (SAM, Figuur 1A) is waarschijnlijk, tweede tot en ATP, het meest gebruikte cofactor in de natuur ^{5, 6.} Het wordt gebruikt als de voornaamste methylgroep donor in alle levende organismen met de chemische reactie wordt gekatalyseerd door SAM-afhankelijke-methyl (MTases), die DNA ^{7, 8} RNA, eiwitten ^9, of kleine moleculen ¹⁰ methylaat. Gezien de cruciale rol van de methylatie reacties in diverse fysiologische scenario's (genregulatie, epigenetica, metabolisme), kan de profilering van MTases worden naar verwachting van even groot belang in functionele proteomics als de profilering van kinases. Analytische hulpmiddelen voor hun profilering, echter, zijn niet beschikbaar. We hebben onlangs een CC met SAH als selectiviteit groep deze technologische kloof (Figuur 1A) te vullen.

SAH, het product van SAM na methyl overdracht, is een bekend algemeen MTase product inhibitor ^11. Om deze reden en omdat de natuurlijke cofactor SAM wordt gebruikt door meer enzymen overdracht van andere delen van de cofactor of het initiëren van radicale reacties als gevolg van de chemische instabiliteit ^12, SAH is een ideale functie voor selectiviteit een CC naar MTases doel. Hier melden wij het ​​nut van de SAH-CC en CCMS door profilering MTases en andere SAH-bindende eiwitten uit de stam DH5a van Escherichia coli (E. coli), een van de best gekarakteriseerd prokaryoten, die gediend heeft als de gewenste model organisme in talloze biochemische, biologische en biotechnologische studies. Foto-geactiveerde verknoping verbetert de opbrengst en de gevoeligheid van het experiment, en de specificiteit kan gemakkelijk worden getest in competitie experimenten met een overmaat aan vrije SAH.

Protocol

1) Bereiding van E. coli DH5a cellysaat

1. Inoculeren een 2 ml cultuur (LB media in een reageerbuis) met de E. coli-stam DH5a direct uit een glycerol voorraad en incubeer bij 37 ° C en 250 rpm gedurende 8 uur Gebruik geautoclaveerd LB media (10 g / l Bacto-trypton, 5 g / L gistextract, 10 g / L NaCl, pH 7,5).
2. Inoculeren 250 ml LB media in een 1 L shaker kolf met schotten met de 2 ml cultuur en incubeer overnacht bij 37 ° C en 166 rpm in een incubator met rondschudapparaat.
3. Inoculeer vier 5 L shaker kolven met schotten met elk 2,5 L LB media met de 250 ml cultuur (50 ml per fles) en incubeer de cultuur bij 37 ° C en 166 rpm tot een OD ₆₀₀ van 0,8 is bereikt.
4. Oogsten van de cellen door centrifugeren bij 4 ° C, 3000x g gedurende 20 minuten. Voer verdere behandeling bij 0-4 ° C of op ijs.
5. Resuspendeer de oogst celmateriaal in Milli-Q water, te combineren in een centrifuge emmer en centrifuge voor een nog eens 30 min bij 6000x g en 4 ° C.
6. Bewaar de resulterende 20 g celmateriaal bij -20 ° C of -78 ° C.
7. Resuspendeer de cellen in 100 ml ijskoude cel opening buffer (6,7 mM MES, 6,7 mM NaOAc, 6,7 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM β-mercapto-ethanol, 200 mM NaCl, pH 7,5, 10% (w / v) glycerol, 0,2 mM PMSF) en ultrasone trillingen drie keer gedurende 1 minuut in vier 25 ml porties op het ijs met behulp van een sonifier (bijv. Sonopuls HD 2070 van Bandelin electronic GmbH & Co KG, maximale amplitude, continu vermogen).
8. Centrifugeer het lysaat 's nachts bij 2370x g en 2 ° C.
9. Concentreer de supernatant aan 14 ml door ultrafiltratie (bijvoorbeeld met iCON Concentrators, 7 mL/9K, van Pierce) op 2370x g en 2 ° C.
10. Afbreken van de viskeuze concentraat van kleine moleculen, zoals SAM of SAH door gelfiltratie bij 2 ° C (bijv. Zeba ontzouten Spin kolommen, 10 ml, van Pierce, vier kolommen, opslag buffer verwijderd 1000x g gedurende 2 min; vier maal evenwicht met 5 ml ijskoude cel opening buffer en buffer verwijderd 1000x g gedurende 2 min, respectievelijk 3,5 ml concentraat toegepast op elke kolom, 45 min centrifugeren bij 24x g, dan twee keer 2 min bij 1000x g)
11. Aanvulling op de resulterende 13 mL lysaat met 13 ml ijskoude glycerol en Roche mini proteaseremmer cocktail tabletten, EDTA vrij. Mengen en oplossen van de tabletten.
12. Bewaar het lysaat bij -20 ° C
13. Bepaal de totale hoeveelheid eiwit concentratie door de Bradford assay (21 mg / ml in het onderhavige geval). Bradford reagens: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 in 50 ml 95% ethanol, voeg 100 ml 85% (w / v) fosforzuur, vul aan tot 1 L als de kleurstof volledig is opgelost, en filtreer door Whatman # 1 papier net voor gebruik.

2) Capture Assay (A), Concurrentie Control (C), Pulldown (PD), Concurrentie Controle van Pulldown (CPD), en gecombineerde Capture Assay plus Pulldown (A + PD)

1. Voor het vastleggen experimenten werd de SAH caproKit (caprotec bioanalytics GmbH) gebruikt, die ook de SAH-CC, gratis SAH als concurrent, streptavidine-gecoate magnetische korrels met een micrometer diameter (Dynabeads MyOne Streptavidine C1, Invitrogen Dynal), 5X capture buffer (5X CB, met 100 mM HEPES, 250 mM kaliumacetaat, 50 mM magnesiumacetaat en 50% glycerol), en 5X wasbuffer (5x WB, met 250 mM Tris HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 5 M NaCl, 42,5 uM _{octyl-β-D-glucopyranoside).}
2. Voor de verschillende parallelle experimenten is het aanbevolen om een master mix van water voor te bereiden, vast te leggen buffer en E. coli lysaat en om reacties uit te voeren binnen de verschillende buizen van een 200 pi-PCR tube strip (aanbevolen 0,2 ml Thermo-Strip, Thermo Scientific, AB-1114). Hier worden hoeveelheden voor een reactie tube gegeven. Resultaten voor vijf verschillende experimenten zullen worden gepresenteerd, die capture assay (A), concurrentie control (C), pulldown (PD), de concurrentie controle van de pulldown (CPD), en gecombineerd capture assay plus pulldown (A + PD).
3. Voor elke reactie, voor te bereiden 1,5 ml 1X WB door het toevoegen van 0,3 ml 5x WB tot 1,2 ml Milli-Q water.
4. Bereid SAH-CC geladen streptavidine-gecoate magnetische korrels (caproBeads) in 200 pi PCR tube strips. Daarom is 25 pi van 100 uM SAH-CC mengen met 50 ul van 10 mg / ml streptavidine-gecoate magnetische korrels voor elk aliquot, krachtig schudden de resulterende suspensies bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten om binding van de biotine-groep van de SAH- CC aan de streptavidine op het magnetische bolletje oppervlak, en het verzamelen van de kralen met behulp van een sterke magneet (bijvoorbeeld in de doppen van de PCR-buis stroken met de caproMagTM magnetisch apparaat, caprotec bioanalytics GmbH). Gooi de supernatanten, resuspendeer de resulterende caproBeads in 200 uL WB, magnetisch verzamelen de caproBeads (in de doppen van de PCR-buis strips), en gooi de supernating WB. Dicht buizen om uitdrogen te voorkomen van de kralen.
5. Bereid hoeveelheden van E.coli DH5a helecellysaat in de nieuwe PCR-buizen op 0-4 ° C met behulp van een master mix (zie 2.2). Voor een reactie, aan te vullen een volume van Milli-Q water voor een laatste reactie mix volume van 100 ul met 20 pi 5x CB. Mix, voeg 0,26 mg E. coli lysaat, en meng door de inversie. Alleen voor C en CPD, voeg 20 ul 10 mM SAH concurrent oplossing en meng door de inversie (add Milli-Q water in plaats van de SAH oplossing voor de A, PD, en A + PD). Teken een 1 ui monster van A voor verdere analyse (zie hieronder).
6. Hang de caproBeads in de respectieve lysaat en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C houden van de parels in suspensie door de rotatie tot omkeerbare binding van SAH bindende eiwitten aan de SAH selectiviteit functie van de SAH-CC mogelijk te maken.
7. Plaats de schorsingen A, C en A + PD in de caproBoxTM (toestel voor het bestralen van biochemische monsters met UV-licht en tegelijkertijd koeling, caprotec bioanalytics GmbH) en bestralen voor een totale tijd van 30 min in de gesloten buizen tussen de 0-4 ° C om een ​​covalente verknopen tussen de reactiviteit functie van de SAH-CC naar de SAH bindende eiwitten te vormen. Daarom is, verwijder dan de suspensies na bestraling met intervallen van 2,5 min, respectievelijk van de caproBoxTM, koel in ijswater voor ~ 15 s (vooral de deksels), meng een paar keer door de inversie, zeer kort (~ 2 s) centrifuge tot opschorting resterende verwijderen in de deksels, en plaats terug in de caproBoxTM voor de volgende bestraling interval.
8. Voeg 20 ul 10 mM SAH oplossing voor een, of 20 pL Milli-Q water tot C, PD, CPD, en A + PD en incubeer de suspensie gedurende 10 min bij 4 ° C aan, verplaatsen in A, SAH bindende eiwitten niet verknoopt aan de SAH-CC. Houd de parels in suspensie door de rotatie of door intermitterende handmatige re-vering.
9. Verzamel de caproBeads van de schorsingen met een sterke magneet (bijv. de caproMagTM), gooi de supernatanten, en was de kralen zes keer - door re-suspensie en collectie - met 200 pi 1X WB en een keer met 200 pi Milli-Q water.
10. De kralen kunnen worden opgeslagen in Milli-Q water gedurende een aantal weken bij 4 ° C. Alternatieve protocollen bestaan ​​voor de verdere verwerking van de gevangen eiwitten en hun identificatie (zie bespreking).
11. Was de kralen drie keer met 200 pi 60% acetonitril (ACN) en laat de gevangen eiwitten uit de kralen door 10 min incubatie bij kamertemperatuur onder krachtig schudden met 200 pi 60% ACN/0.2% trifluorazijnzuur (TFA) (vers te bereiden) . Gebruik LC-MS-grade reagentia en water.
12. Magnetisch verzamelen van de kralen, scheiden en verdampen het supernatant droog met behulp van een centrifugale verdamper (bijv. MiVac DNA concentrator uit GeneVac, Inc, Verenigd Koninkrijk). Gooi de kralen.

3) SDS-PAGE van Captured Eiwitten

1. Voor de SDS-PAGE, ontbinding van de gevangen eiwitten vrij uit de magnetische korrels (verdampt ACN / TFA-oplossingen van stap 2.12) in 20 pi SDS sample buffer (50 mM Tris HCl, 320 mM β-mercapto-ethanol, 2,5% SDS, 0,05% broomfenolblauw , 10% glycerol, pH 6,8). Meng de ui een steekproef van A (zie stap 2.5) met 19 pi SDS sample buffer, het gebruik 5 pi van deze oplossing voor SDS-PAGE-analyse (0,25% van de test). Verhit de monsters in SDS sample buffer 10 min tot 95 ° C en laat laat afkoelen tot kamertemperatuur.
2. Analyseren door SDS-PAGE (generieke setup: OLS ® ProPage 4-20% Tris / glycine pre-cast gels; OLS OmniPage mini-gel-elektroforese systeem; SDS draait buffer: 25 mM Tris base, 200 mM glycine, 0,1% SDS, pH 8,3 ; looptijd 90 minuten bij een constante spanning van 180 V, onder ijs koeling van de SDS lopen buffer).
3. Zilveren vlekken op de gel met behulp van een MS-compatibele zilveren vlek methode (bijvoorbeeld ProteoSilver Silver Stain Kit van Sigma). Een vertegenwoordiger resultaat is weergegeven in figuur 2.

4) In-gel Tryptische Digest van eiwitten en peptiden Extractie van Gel Bands

1. Was het zilver gekleurde gel minstens drie keer met 100 ml Milli-Q water gedurende 10 minuten na de zilveren vlek stop oplossing werd verwijderd.
2. Knip de gel bands (bijvoorbeeld met een schone scalpel en overbrengen naar een 0,5 ml Eppendorf buis) en bewaar bij -20 ° C of direct te verwerken. Was de gel banden voor 15 min, respectievelijk met 100 pL water, 100 ul 50% ethanol, 100 ul water, 100 ul 50% ethanol en voor 5 min met zuivere ethanol. Herhaal deze procedure nog eens wassen.
3. Re-hydraat de gel band met 10 pi in-gel spijsvertering oplossing (12,5 ng / ul sequencing graad trypsine in 50 mM ammoniumbicarbonaat, voor te bereiden door het toevoegen van 7,5 pi 0,5 ug / ul trypsine oplossing in 1 mM HCl tot 292,5 pi 50 mM ammoniumbicarbonaat ) gedurende 45 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en te vervangen door 20 pi 50 mM ammoniumbicarbonaat (zonder trypsine), gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende de nacht tijdens het schudden.
4. Verzamel de supernatant. Voor de peptide-extractie, incubeer de gel band met 20 ui 5% mierezuur (FA) gedurende 15 minuten onder schudden, toe te voegen20 pi ACN en gedurende nog eens 15 minuten onder schudden. Combineer het supernatant met de vorige supernatant en herhaal de peptide extractieprocedure opnieuw.
5. Damp de gecombineerde drie bovenstaande vloeistoffen tot droog, los op in 10 ui 5%, terwijl FA schudden en het toepassen van echografie (ultrageluid bad, bijvoorbeeld Sonorex uit Bandelin, Duitsland) en gaan met ontzouting (stap 5.2 en verder).

5) Tryptische Digest van Captured eiwitten en bereiden van peptiden voor LC-MS/MS

1. Los van de gevangen eiwitten vrij uit de magnetische korrels (verdampt ACN / TFA-oplossingen van stap 2.12) in 10 pi 50 mM ammoniumbicarbonaat met behulp van een ultrasoon bad en vortexen, voeg 1 ui 0,5 ug / ul trypsine in 1 mM HCl en incubeer de oplossing bij 37 ° C gedurende de nacht.
2. Ontzouten van de oplossing die de tryptische peptiden van de gevangen eiwitten met behulp van C18 materiaal (bijv. 20-10 il StageTips, 20 pL tip, Proxeon Biosystems A / S, Odense, Denemarken, fabrikant volgt: pre-conditie met 10 pi 50% methanol / 5 % FA, evenwicht met 10 pi 5% FA, belasting met peptiden van gevangen eiwitten, wassen met 10 pi 5% FA, elueren tweemaal met 10 pi 50% methanol / 5% FA).
3. Damp de ontzout peptiden in 50% methanol / 5% FA tot droog, los op in 5,5 ui 0,1%, terwijl FA schudden en het toepassen van echografie (ultrageluid bad) en analyseren van het monster door nanoLC-MS/MS.

6) NanoLC-MS/MS Analyse

1. Overdracht monster in monster bord en laat de plaat in de nano-flow vloeistofchromatografie (nanoLC) systeem (bijv. Easy-NLC vloeistofchromatografie systeem; Proxeon Biosystems A / S, Denemarken).
2. Gebruik 0,1% FA in water als mobiele fase A en 0,1% FA in ACN als mobiele fase B. Gebruik alleen LC-MS kwaliteit oplosmiddelen.
3. Belasting 5 pi van het peptide-oplossing direct op een pre-kolom (bijv. nanoflow Biosphere C18, 5 micrometer, 120 A, 20 x 0,1 mm, NanoSeparations, Nederland) gekoppeld aan een analytische kolom (bijv. nanoflow Biosphere C18, 5 micrometer, 120 Å , 100 x 0.075 mm; NanoSeparations, Nederland) met behulp van 5% ACN/0.1% FA.
4. Tijdens de LC, elueren peptiden tijdens een 80 minuten lineaire gradiënt van 5% ACN/0.1% FA tot 40% ACN/0.1% FA, gevolgd door een extra 2 min tot 100% ACN/0.1% FA en de resterende 100% ACN/0.1% FA voor nog eens 8 minuten met een gecontroleerde debiet van 400 nL / min.
5. Voer massaspectrometrie (MS) analyse van geëlueerd peptiden op een hoge nauwkeurigheid state-of-the-art massaspectrometer (bijv. LTQ Orbitrap XL massaspectrometer, Thermo FisherScientific, Duitsland, uitgerust met een nanoelectrospray ionenbron voor electrospray ionisatie (ESI); Proxeon Biosystems A / S, Denemarken).
6. Voer de massaspectrometrische analyse in het data-afhankelijke functie voor het automatisch schakelen tussen Orbitrap-MS (profiel-modus) en LTQ-MS/MS (centroïde mode) acquisitie.
7. De controle van de massa-spectrometer duty cycle door het instellen van de injectie tijd Automatic Gain Control.
8. Acquire survey full-scan MS-spectra (van m / z 300 tot 2000) in de Orbitrap met de resolutie van r = 60.000 bij m / z 400 (na accumulatie tot een streefwaarde van 500.000 ladingen in de lineaire ion trap).
9. Stel het instrument om sequentieel te isoleren van de meest intense ionen (tot vijf, afhankelijk van de intensiteit van het signaal) voor fragmentatie in de lineaire ion val met behulp van een botsing-geïnduceerde dissociatie (CID) bij een streefwaarde van 10.000 kosten. Het resulterende fragment ionen worden opgenomen in de LTQ.
10. Voor nauwkeurige massa metingen in de MS-modus, gebruikt u de enkelvoudig geladen polydimethylcyclosiloxane achtergrond ion (Si (CH _{3) 2} O) ₆ H ⁺ (m / z 445.120025) die tijdens de electrospray proces van omgevingslucht als het slot massa voor real-time interne herijking.
11. Dynamisch al uit te sluiten doelwit ionen massa-geselecteerd voor CID voor de duur van 60 s.
12. Stel laadtoestand screening en afwijzing van ionen voor de CID met een niet-toegewezen kosten.
13. Verder massaspectrometrische instellingen zijn als volgt: stel spuiten spanning op 1,6 kV, ingestelde temperatuur van de verhitte overdracht capillair tot 200 ° C, en genormaliseerd botsingsenergie is 35% voor MS ^2. De minimale signaal nodig is voor MS ² is 500 telt. Breng een activatie q = 0,25 en een activering tijd van 30 ms voor MS ^twee acquisities.
14. Voor het reinigen van het LC-systeem, voert u een lege rijden tussen twee opeenvolgende CCMS metingen.

7) peptide en proteïne identificatie via Automated Sequence Database Search

1. Gebruik een eiwit identificatie algoritme om de MS / MS-gegevens (in dit geval opgeslagen in het raw-bestanden), bijvoorbeeld Sequest geïmplementeerd in BioworksBrowser 3.3.1 SP1 (Thermo FisherScientific, Duitsland) en X! Tandem (The Global Proteome machine-organisatie te analyseren; versie 2007.01.01.1) geïmplementeerd in de Scaffold 3 software (versie Scaffold_3_00_03, Proteome Software Inc, USA).
2. Voer geautomatiseerde database zoeken tegen de meest recente UniProtKB / Zwitserse-Prot databank vrijkomen www.expasy.org van het organisme onderzocht (database die wordt gebruikt voor de huidige studie: Escherichia coli, stam K12, release 57-11).
3. Gebruik de volgende instellingen voor geautomatiseerde database zoeken binnen Sequest: 5 ppm precursor tolerantie, 1 amu fragment ion tolerantie, en de volledige trypsine specificiteit waardoor maximaal twee gemiste splitsingen. Laat als variabele wijzigingen fosforylatie op serine, threonine, tyrosine en, oxidatie van methionines; deamidatie op asparaginen en glutamine; acetylering bij lysine en serine; formylering bij lysine, en methylatie in arginine, lysine, serine, threonine, en asparagine. Gebruik geen vast wijzigingen in de database zoeken.
4. Belasting SRF of dta en uit bestanden gegenereerd door Sequest naar het schavot 3, die waarschijnlijk de beoordeling van peptide opdrachten en eiwitidentificaties door het combineren van Sequest en X! Tandem database-zoekopdrachten uitvoert. Steiger is handig voor het eenvoudig vergelijken en visualiseren eiwit lijsten van verschillende monsters (in casu A, C, PD, CPD, en A + PD).
5. Stel de parameters in het schavot 3 software om alleen peptiden overwegen met ≥ 95% kans zoals gespecificeerd door de Peptide Profeet algoritme (ref.13). Stel eiwit identificatie van kansen voor meerdere peptide opdrachten aan ≥ 95% volgens de Protein profeet algoritme ^13. Voor een peptide eiwitidentificaties, willekeurig ingesteld eiwit kans op ≥ 50% en handmatig controleren van de overeenkomstige peptide MS / MS spectra. Eiwitten die soortgelijke peptiden bevatten en niet kan worden gedifferentieerd op basis van MS / MS analyse alleen worden gegroepeerd door de software aan de principes van zuinigheid te voldoen. De geschatte valse ontdekking snelheid van peptide identificaties kan worden bepaald met behulp van de omgekeerde eiwit databank aanpak en moet <1%.
6. Representatieve resultaten van het CCMS experimenten worden gegeven in de tabellen 1, 2, en Aanvullende Tabel S1 (let op dat het eiwit database niet up-to-date voor sommige eiwitten, bijv. PrmB (aka YfcB) of RsmH (aka MraW)), maar ook zoals in figuur 3.

8) representatieve resultaten

Tabel 1:

Eiwit	ORF	MW / kDa	Beschrijving	Substraat	Een	C	PD	CPD	A + PD
Dcm	b1961	53,5	DNA-cytosine MTase	DNA (m5C)	1	0	0	0	1
RlmI	b0967	44,4	23S rRNA m5C1962 MTase	rRNA (m5C)	17	0	17	0	20
RlmL	b0948	78,9	23S rRNA m2G2445 MTase	rRNA (m2G)	12	0	0	0	10
TrmB	b2960	27,3	tRNA (guanine-N (7) -)-MTase	tRNA (m7G)	11	0	0	0	13
CmoA	b1870	27,8	tRNA (cmo5U34)-MTase	tRNA (mcmo5U)	7	0	0	0	4
RsmG	b3740	23,4	16S rRNA m7G MTase	rRNA (m7G)	6	0	1	0	5
RsmH	b0082	34,9	16S rRNA m4C1402 MTase	rRNA (m4c)	5	0	0	0	7
RsmD	b3465	21,7	16S rRNA m2G966 MTase	rRNA (m2G)	2	0	0	0	2
RsmB	b3289	48,3	16S rRNA m5C967 MTase	rRNA (m5C)	1	0	0	0	0
MnmC	b2324	74,4	Bifunctionele eiwit bevat tRNA (MNM (5) s (2) U34)-MTase	tRNA (mnm5s2U)	1	0	0	0	0
PrmB	b2330	35,0	50S ribosomaal proteïne L3 Gln150 MTase	eiwit (Gln)	13	0	0	0	15
Cher	b1884	32,8	Chemotaxis eiwit MTase	eiwit (Glu)	0	0	0	0	1
CFA	b1661	44,9	Cyclopropaan-vetzuur-acyl-fosfolipide synthase	kleine molecule	15	0	0	0	14
Tam	b1519	29,0	Trans-aconitinezuur 2-MTase	kleine molecule	2	0	0	0	3
CysG	b3368	50,0	Siroheme synthase omvat uroporphyrinogen-III C-MTase	kleine molecule	1	0	0	0	2
SmtA	b0921	29,8	Eiwit smtA	(? A)	7	1	0	0	8
MtnN	b0159	24,4	5'-Methylthioadenosine / SAH nucleosidase	klein molecuul b	36	0	0	0	39
GlnA	b3870	51,9	Glutamine synthetase	klein molecuul c	90	0	0	0	97
RplK	b3983	14,9	50S ribosomale eiwit L11	van eiwitten MTase PrmA d	2	0	0	0	2

^een niet (volledig) gekenmerkt

^b Nee methylatie, maar de splitsing van de glycosidebinding van SAH

^c Geen methylatie, maar de binding van SAB in de ATP bindingsplaats zoals blijkt uit CCMS experimenten met ATP als concurrent (gegevens niet getoond)

^d substraat van de 50S ribosomale eiwit L11 MTase PrmA; reproduceerbaar specifieke identificatie door de CCMS (gegevens niet getoond)

Tabel 1: MTases en andere geselecteerde eiwitten geïdentificeerd door CCMS experimenten. De gegeven cijfers geven de ongewogen peptide spectrale tellen per eiwit. Monsters zijn duplicaten van die geanalyseerd door SDS-PAGE/silver vlek in figuur 2. Veel meer MTases en andere SAH bindende eiwitten worden geïdentificeerd in het CCMS assay (A) in vergelijking met de pulldown (PD) en de SAH specificiteit blijkt uit de bijna volledige afwezigheid van deze eiwitten in de competitie controle (C).

Tabel 2:

	Een	C	PD	CPD	A + PD
Een	111 (64)
C	65 (41)	107 (46)
PD	25 (15)	23 (13)	61 (17)
CPD	23 (13)	22 (12)	20 (14)	47 (14)
A + PD	87 (61)	64 (41)	23 (14)	22 (12)	124 (67)

Tabel 2: Totaal aantal geïdentificeerde eiwitten in de CCMS loopt en eiwit overlap tussen de pistes. Het aantal eiwitten geïdentificeerd met minstens twee peptiden worden gegeven tussen haakjes. De hoge reproduceerbaarheid van de methode kan worden afgeleid uit het hoge eiwit overlap (van voornamelijk niet-specifieke eiwitten) tussen vergelijkbare experimenten (A vs C en vooral A vs A + PD, maar ook PD vs CPD), vooral met de eiwitten robuust geïdentificeerd met minstens twee peptiden. Zie ook figuur 3 voor Venn-diagrammen en aanvullende Tabel S1 voor een lijst van alle geïdentificeerde eiwitten.

Figuur 1A: Chemische structuur van de trifunctionele Capture Compound (CC). De selectiviteit functie wordt omlijst met een druppel, de reactiviteit functie met een ster, en de sortering functie met een halve maan. De chemisch stabiel _{S-adenosyl-L-homocysteine} ​​(SAH) is het cofactor product van _{S-adenosyl-L-methionine} (SAM) na methylgroep overdracht door SAM-afhankelijke MTases, waarvoor SAH werkt als een product-remmer.

Figuur 1b: CCMS "on-kraal "workflow. De CC is gebonden op de magnetische korrels door de sorteer-functie (a), worden de zo gevormde caproBeads geïncubeerd met het complex eiwitmengsel (b), waar een reversibele binding evenwicht (c) is tot stand gebracht tussen de selectiviteit van de functie de CC en het doel eiwitten. bij UV bestraling (d), van de reactiviteit functie vormt een covalente verknopen. Na het wassen van de magnetische korrels met het gevangen eiwitten (e), splitsing van de verknoopte CC-eiwit-complexen van de magnetische korrels (f) , en tryptische verteren (g), kan de gevangen eiwitten geïdentificeerd worden door MS analyse van de tryptische peptiden.

Figuur 2: SDS-PAGE/silver vlek analyse van gevangen eiwitten (na stap f in figuur 1B). De baan omschrijving wordt gegeven op de top van de gel (MW: moleculair gewicht marker met de overeenkomstige molecuulgewichten van de marker bands gegeven aan de zeer rechts, L: 0,25% steekproef getrokken uit de E. coli DH5a hele cellysaat voor het toevoegen van de caproBeads in stap b in Figuur 1B, A: test met toevoeging van een overmaat aan vrije SAH na UV straling stap d in figuur 1B, C: controle van de assay met een overmaat aan vrije SAH als concurrent tijdens stap c en d in figuur 1B (essentieel om vast te stellen een niet-specifiek vastgelegd eiwitten), PD: pulldown betekent dat er geen UV-straling stap d in figuur 1B en geen toevoeging van de vrije SAH, CPD: de controle van pulldown gebruik van SAH als concurrent, A + PD: gecombineerd test plus pulldown betekent dat er geen aanvulling van de vrije SAH tijdens de workflow). Eiwitten geïdentificeerd door MS van de cut-out eiwitgel bands na in-gel tryptische verteren worden gegeven aan de zeer leftt. Het is duidelijk dat foto-crosslinking opbrengst en de gevoeligheid van het experiment verbetert, en de specificiteit kan gemakkelijk worden getest in competitie experimenten met een overmaat aan vrije SAH. Zie tabel 1 voor MTases en andere geselecteerde eiwitten geïdentificeerd door CCMS experimenten van duplo-monsters van die welke in de huidige figuur.

Figuur 3: Venn-diagrammen explaning de overlap van de geïdentificeerde eiwitten in CCMS assay (A), concurrentie control (C), en pulldown (PD). Links: Aantal MTases en SAH nucleosidase, alleen, met verwijzing naar tabel 1. Rechts: aantal van alle geïdentificeerde eiwitten met betrekking tot tabel 2 en aanvullende Tabel S1. Het aantal eiwitten geïdentificeerd met minstens twee peptiden worden gegeven tussen haakjes.

Discussie

De volgende voorzorgsmaatregelen en opmerkingen kunnen nuttig zijn bij het volgen van het beschreven protocol: a) Een groot voordeel van CCS ligt in de vorming van een covalente binding tussen de CC en de MTase, omdat dit toelaat de volgende stringente wasomstandigheden. De covalente crosslink wordt bereikt door een fotoreactie veroorzaakt door UV-licht (310 nm max.). Normale overhead licht bevat slechts een kleine fractie van de UV, echter, de bescherming van de SAH-CC van langere blootstelling aan overhead of zelfs zonlicht tot de gecontroleerde en afgekoeld bestraling in de caproBox. b) De biologische monsters waaruit de MTases moeten worden geïsoleerd bevatten eiwitten die gevoelig zijn voor denaturatie, daarom is het verplicht om de monsters koel en om te voorkomen dat schuim op alle tijden. c) De caproBox koelt de monsters naar 0-4 ° C, de lampen die zo UV-licht, echter ook warmte uitstralen. Daarom is het noodzakelijk om in het kort de vaatjes voor de bestraling, zodat eiwitten zich te houden aan de doppen of injectieflacon wanden kunnen geen neerslag zaden. d) Indien re-schorsing van het magnetische korrels (bijvoorbeeld in de wasoplossingen) is niet mogelijk met de hand, kort van toepassing echo door het plaatsen van de monsters in een ultrasoon bad. e) vers bereiden de 0,2% TFA/60% ACN-oplossing. We vonden dat anders de gevangen eiwitten niet kan worden gesplitst van de kralen. f) De uiteindelijke analyse van de gevangen eiwitten wordt uitgevoerd door LC-MS/MS. Massaspectrometrie is een zeer gevoelige methode. Het is noodzakelijk om uitsluitend LC-MS kwaliteit reagentia te gebruiken in de laatste stappen (stap 2.11 en verder). Verontreiniging van de experimenten door externe bronnen van eiwit, bijvoorbeeld keratine die afkomstig zijn van stof of van de experimentator. Vooral tijdens de laatste spijsvertering stappen, is het raadzaam om aandacht te besteden aan een schone werkplek, om handschoenen en een laboratoriumjas en eventueel een haarnet dragen of ideaal voer de laatste stappen in een schone bank. Bereid de 50 mM ammoniumbicarbonaat buffer gebruikt voor tryptische digest in LC MS kwaliteit water, filteren door middel van 0,22 urn filter, aliquoot, bewaren bij -20 ° C, en gebruiken elk aliquot slechts een keer aan verontreinigingen te voorkomen. De trypsine oplossing (sequencing rang, Roche, bereiden een 0,5 ug / ul-oplossing door het toevoegen van 1 mM HCl tot gevriesdroogde trypsine) kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele weken. g) Voor het verkrijgen van betrouwbare massa spectra is het essentieel te beschikken over een stabiele spray in ESI-MS/MS analyse. h) Voor andere LC-MS/MS systemen dan degene gebruikt in de huidige studie, moeten meten parameters en peptide identificatie algoritmen individueel aangepast worden.

De volgende wijzigingen mogelijk zijn met betrekking tot de beschreven protocol: a) Als alternatief voor het vrijgeven van de eiwitten van de kralen met 60% ACN/0.2% TFA (stap 2.11), kunnen de eiwitten tryptically direct worden verteerd in een kraal suspensie (dezelfde volumes als in stap 5.1) of, voor SDS-PAGE, kunnen de eiwitten worden vrijgegeven door schorsing en het verwarmen van de kralen verzameld na stap 2.9 tot 95 ° C gedurende 10 min in SDS sample buffer (zowel de volledige schorsing of alleen het supernatant kan worden geladen in de gel zak). Wij vonden dat de kralen langzaam kleine hoeveelheden polymeer introductie in de waterige oplossing tryptische verteren tijdens de on-bead tryptische verteren, zelfs na een aantal waterige wassen stappen. Het polymeer besmetting interfereert met MS peptide identificatie en kunnen gewassen uit de beads met 80% ACN (minstens drie keer). Na de 80% ACN wasstappen, moet de kralen een keer worden gewassen met water voorafgaand aan de on-bead tryptische verteren. b) de Western blots met behulp van streptavidine-peroxidase horseraddish en ECL substraat kan ook gebruikt worden om succesvol verknoping van de biotine met CC te visualiseren aan de eiwitten. Daarom, ofwel de gel verkregen na stap 3.2 kan worden uitgewist of, omdat de gevoeligheid is ongeveer een factor 10 hoger dan zilverkleuring van gels, kan 10 pi monsters na stap 2.7 ook worden geanalyseerd door western blot. Let erop dat in het laatste geval endogeneously gebiotinyleerd eiwitten ook worden gedetecteerd naast de eiwitten kunstmatig gebiotinyleerde door de SAH-CC. c) We vonden dat het afhangt van de bijzondere regeling (lysaat, gericht doeleiwitten, selectiviteit en reactiviteit functie van hij CC), of de "off-hiel" configuratie, waar de verknopingsreactie plaatsvindt tussen vrije CC en eiwit in oplossing ⁴ of de thans beschreven "on-bead" configuratie (Figuur 1B) beter presteert.

In het algemeen moet de methode ook compatibel met alle state-of-the-art stabiele isotoop eiwit of peptide labeling technologie, of de beoordeling van de capture monster door 2D-gelelektroforese. In de "off-bead" configuratie, is het ook mogelijk om eiwitten te vangen binnen het gehele cellen (niet-gepubliceerde resultaten). Bovendien kan het geneesmiddel of cofactor bindingsplaats van een eiwit worden geschetst door het bepalen van de close-door verknoping positie van de CC in de eiwitsequentie door MS peptide sequencing. De binding modus van een klein molecuul aan een eiwit kan worden onderzocht door het gebruik van verschillende cCHEMISCHE bevestiging functies bij de selectiviteit functie en verschillende linker lengtes. Zoals te zien is in de huidige studie, ook eiwitbinding partners van de eiwitten aangepakt door de selectiviteit functie (RplK als substraat van PrmA) of onbekende klein molecuul eiwit interacties (SAH naar GlnA) kunnen worden geïdentificeerd. Samengevat, de extra functie van de CCS, de foto-crosslinking reactiviteit, zorgt voor de isolatie en identificatie van laag overvloedige eiwitten of functionele eiwit families van complexe eiwitmengsels met een hoge gevoeligheid en biedt wetenschappers met een extra instrument voor het bestuderen van kleine molecule - eiwit interacties .

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SAH caproKit™	caprotec bioanalytics GmbH	1-1010-050 (50 reacties) 1-1010-010 (10 reacties)	Bevat de SAH-CC, SAH-competitor, streptavidine-gecoate magnetische beads, opvangbuffer en wasbuffer
caproBox™	caprotec bioanalytics GmbH	1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)	Voor reproduceerbare foto-activatie tijdens het koelen van de monsters
caproMag™	caprotec bioanalytics GmbH	1-5100-001	Voor eenvoudig beheer van magnetische deeltjes zonder pipetteren