De muis model van In utero Transplantatie is een veelzijdig instrument dat kan worden gebruikt om de potentiële klinische toepassingen van stamcel transplantatie en gentherapie in de foetus te bestuderen. In dit protocol, presenteren we een algemene aanpak voor het uitvoeren van deze techniek
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een muis model van de In Utero Transplantatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De transplantatie van stamcellen en virussen in de baarmoeder heeft een enorm potentieel voor de behandeling van aangeboren stoornissen in de menselijke foetus. Bijvoorbeeld, in utero transplantatie (IUT) van hematopoietische stamcellen is gebruikt om succesvol te behandelen patiënten met een ernstige gecombineerde immunodeficiëntie. 1,2 In een aantal andere voorwaarden is echter IUT is geprobeerd, zonder succes. 3 Gezien deze gemengde resultaten, de beschikbaarheid van een efficiënte niet-menselijke model om de biologische gevolgen van stamcel transplantatie en gentherapie studie is van cruciaal belang om dit gebied te bevorderen. Wij en anderen hebben gebruikt met de muis model van de IUT naar factoren die van invloed succesvolle innesteling in de baarmoeder van de getransplanteerde hematopoietische stamcellen in zowel wild-type muizen 4-7 en mensen met een genetische ziekten te bestuderen. 8,9 De foetale omgeving ook aanzienlijke voordelen voor de aanbiedingen het succes van in utero gentherapie. Zo heeft de levering van adenovirale 10, adeno-geassocieerde virale 10, retrovirale 11, en lentivirale vectoren 12,13 in de foetus resulteerde in de transductie van meerdere organen ver van de plaats van injectie met een lange-termijn genexpressie. In utero gentherapie kan daarom worden beschouwd als een mogelijke behandeling strategie voor enkel gen aandoeningen, zoals spierdystrofie of taaislijmziekte. Een ander potentieel voordeel van IUT is de mogelijkheid om immuun tolerantie te induceren van een specifiek antigeen. Zoals te zien in muizen met hemofilie, de invoering van factor IX vroeg in de ontwikkeling resulteert in een tolerantie voor dit eiwit. 14
In aanvulling op het gebruik ervan bij het onderzoek naar mogelijke menselijke therapieën, kan de muis-model van de IUT zijn een krachtige tool om fundamentele vragen in de ontwikkelings-en stamcel biologie te bestuderen. Bijvoorbeeld, kan men leveren verschillende kleine moleculen voor het induceren of specifieke gen expressie te remmen bij bepaalde stadia zwangerschapsdiabetes en ontwikkelingstrajecten te manipuleren. De impact van deze wijzigingen aangebracht kunnen worden beoordeeld op verschillende tijdstippen na de eerste transplantatie. Bovendien kan een transplantatie pluripotent of lineage specifieke progenitor cellen in de foetale omgeving om stamcellen differentiatie in een niet-bestraalde en onverstoord hostomgeving bestuderen.
De muis model van de IUT heeft reeds tal van inzichten binnen het gebied van immunologie, en de ontwikkelings-en stamcel biologie. In deze video-gebaseerd protocol, beschrijven we een stap-voor-stap benadering tot het uitvoeren van IUT in muis foetussen en een overzicht van de kritische stappen en mogelijke valkuilen van deze techniek.
Protocol
1. Voorbereiding van de injectie Pipettes
- Kalibreer de pipet trekker zodanig dat een scheiding van de glazen pipet gebeurt binnen de 15 seconden (zie instructies van de fabrikant met betrekking tot kalibratie). De pipet zal een taper waar het scheidt.
- Snijd het uiteinde van de pipet zodanig dat de afstand vanaf het begin van de conus aan het einde van de pipet is 1.04cm naar 1.05cm. De lengte van de pipet is omgekeerd evenredig met het kaliber van de pipet opening. Wees u ervan bewust dat het maken van een langere pipet resulteert ook in een zwakkere tip dat is meer gevoelig voor breuk tijdens de injectie.
- De volgende stap in het maken van de pipet is om een vlotte bevel te creëren door het aanscherpen van de tip over een diamant slijpen wiel. Op het moment van het snijden van de pipet om de juiste grootte, de pipet breekt vaak met een natuurlijke vellingkant op de punt die moet worden gebruikt bij het plaatsen van de pipet op het wiel. Tijdens dit proces, is het belangrijk om voorzichtig rest van de pipet op de verscherping wiel en op gezette tijden opnieuw te evalueren om te controleren of de pipet is nog steeds het wiel te raken (zoals het bevel wordt gladder, zal het contact verliezen met de verscherping wiel).
- Zodra de schuine kant is glad, moet de pipetpunt worden aangescherpt (figuur 1). Verhoog de pipet zodanig dat het niet langer de verscherping wheel aanraakt, draai de klok met de 10-50 graden, en plaats de pipet terug op het draaiende wiel slijpen voor ~ 10 seconden. Zuig de pipet uit de verscherping wiel en nu onderzoekt de rand. Deze stap moet meestal worden herhaald met een aantal kleine aanpassingen te maken een scherpe rand. Als de pipet wordt geplaatst op zijn kant te lang, is het meer kans op een oneffen ondergrond (figuur 1) te ontwikkelen. Na het voltooien van de ene kant, dan kunt u verder naar de tegenoverliggende rand aanscherpen door het herhalen van de bovenstaande stappen.
- Gebruik een permanent marker op een omtrek lijn waarvan elk 4mm te beginnen waar de conus van de pipet begint te tekenen. Deze afbakening komen overeen met 5uL van het volume.
2. Utero in Transplantation
- Na bereiding van de injecteerbare materiaal (bijv. cellen, virussen, etc.) kunt u ingesteld voor de injectie. We maken gebruik van een microinjector aangesloten op perslucht met de volgende instellingen: (Pressure instellingen: ingang 60-80 psi, vul 40 psi, injecteren 8-12 psi, balans 0 psi, houdt u 0 psi; Injection tijd 100 milliseconden).
- Voor het steriliseren van de injectie pipet, twee keer schoon met 70% EtOH, gevolgd door tweemaal met steriele 1X PBS. Als de punt van de pipet is zeer fragiel, raden we autoclaaf de injectie pipetten.
- Injecties kan worden gedaan met behulp van 2,5 maal 3,5 maal vergroting-loepen of een dissectie microscoop. Bereid uw procedure gebied met een warming-deken, verlichting, en de noodzakelijke chirurgische instrumenten.
- Verdoven de zwangere muis (we maken gebruik van isofluraan en zuurstof geleverd via een continue stroom anesthesie-eenheid). Plaats de muis op een verwarmingselement in de rugligging en bevestig elke ledemaat met tape om de muis vast te zetten.
- Clip de vacht. Dan, het dragen van steriele chirurgische handschoenen, de buik prep met 10% povidonjood, gevolgd door alcohol, en injecteer een pijnstiller, zoals buprenorfine.
- Maak een incisie van 1 cm in de onderbuik (de meest inferieure aspect van de incisie moet ongeveer 1 cm hoger dan de introïtus). Incise de huid en de fascia. Wees voorzichtig dat u de buikorganen (darmen en blaas) die onmiddellijk onder de dunne laag van de fascia verwonden.
- Met behulp van wattenstaafjes, voorzichtig rekken van de fascia en leveren de zwangere baarmoeder via de incisie. Tel het totaal aantal foetussen door eerst het identificeren van de rechts en links eierstokken te zorgen dat u visualiseren van de gehele baarmoeder. Plaats de baarmoeder in de buikholte voordat u verder gaat, zodat de foetussen warm blijft terwijl je voor te bereiden op de injecties.
- Trek de juiste hoeveelheid van het materiaal voor het aantal foetussen u van plan bent om te injecteren. Tijdens het vullen van de naald in uw steekproef, is het belangrijk om de pipetpunt ondergedompeld om te voorkomen dat opzuigen uw monster in de microinjector slang. Aangezien de cellen zijn over het algemeen in een klein volume, we meestal plaats ze in een kleine microcentrifuge (ex: 0,5 ml) buis of direct op een stuk van Parafilm te kunnen om de naald te vullen zonder de pipetpunt.
- Voorzichtig vasthouden elke foetus en identificeren van het deel van de foetus u van plan bent om te injecteren (bijvoorbeeld lever, peritoneale holte, been, etc). Met je duim en wijsvinger, moet u het stabiliseren van de foetus in het vruchtwater holte, zodat het niet draait terwijl u het uitvoeren van de injectie. Het is belangrijk om te houden van de foetus stevig genoeg om nog te stabiliseren voorzichtig genoeg om te voorkomen dat het te beschadigen.
- Steek de pipet door de baarmoeder, amnion, en foetale huid en in het doelorgaan. Als de pipet is scherp, moet het gemakkelijk door deze weefsels. Als de pipet tip is saai, je wi zult merken tenten van de baarmoeder en vruchtwater membranen. Injecteer het gewenste volume in elke foetus. Het is noodzakelijk dat uw bewegingen stabiel zijn tijdens de tijd van de insertie, injectie, en intrekking van de pipet.
- Zodra het gewenste volume wordt geïnjecteerd, zorgvuldig te trekken van de pipet. Als dit goed wordt gedaan, wanneer het materiaal niet uit lekken uit de amnionholte of baarmoeder. Als er een groot gat gemaakt in het amnion, die men kan herkennen door verlies van vruchtwater, dan overleven in gevaar wordt gebracht. Tot slot, voor studies die postnatale oogst te betrekken, moeten alle foetussen ontvangen technisch perfecte injecties, omdat er geen manier is om ingespoten en uninjected foetussen te onderscheiden na de geboorte.
- Als u het uitvoeren van injecties in de foetale lever, kan deze soms bloed in de pipetpunt nadat het is ingetrokken, dit bevestigt dat je in de juiste positie en mag geen invloed op de overleving. Als het uitvoeren van intraperitoneale injecties, richt iets onder de foetale lever. Voor intramusculaire injecties, kan u de positie van de foetus aan de heup en dijbeen te identificeren en de gluteus spieren injecteren. Tot slot, voor intraventriculaire injecties, is het gemakkelijk om de coronale hechtingen zien de pipet rechtstreeks naar de juiste doelgroep. Voor deze injecties, zijn iets groter kaliber pipetten nodig zijn om de schedel dringen zonder de pipet.
- Vervolgens voorzichtig terug te plaatsen de baarmoeder in de buikholte. Zorg ervoor dat het niet gedraaid op zichzelf of rond de vasculaire leveren. Lever 1 ml van de steriele 1X PBS in peritoneale holte van de moeder aan een vloeistof die verloren is gegaan tijdens de procedure te vervangen. Sluit de incisie in 2 lagen met een 5-0 gevlochten resorbeerbaar garen (ex: Vicryl). Sluit eerst de fascia, zonder dat de onderliggende darm of blaas, en sluit de huid.
- Op dit moment, kan na de procedure medicijnen worden toegediend voor analgesie. Return elke ingespoten vrouwelijk naar een eigen kooi en plaats de kooi op een warming deken. Monitor de muis tot hij rechtop staat. Zet beddengoed in de kooi en plaats de muis in een rustig gedeelte van de muis faciliteit waar het niet mag (dus geen kooi reiniging) gestoord worden pas enkele dagen na de bevalling. Het minimaliseren van eventuele extra belasting voor het dier vermindert de kans op premature arbeid.
- Zodra u klaar bent met de injecties, twee maal reinigen van uw pipet met steriele 1X PBS en een keer met 70% EtOH.
- Geïnjecteerd vrouwen moeten dagelijks worden geobserveerd om ze herstellen van de procedure te verzekeren zonder problemen. De incisie moet worden gecontroleerd op zwelling, ontsteking, wond scheiding, en andere tekenen van infectie. Post-operatieve pijnstillers kan worden toegediend als dat nodig is.
3. Representatieve resultaten:
Overleving van de geïnjecteerde foetussen te verkrijgbaar is de belangrijkste beperkende factor voor het bereiken van succes met deze techniek. Afhankelijk van het materiaal geïnjecteerd en de stam van de muis wordt gebruikt, kan de overlevingskansen variëren. In het algemeen dienen de injecties van hematopoietische cellen in wild-type muizen op E14 resulteren in ten minste 50% levend geboren pups. Hogere overlevingskansen zijn mogelijk afhankelijk van zowel de technische aspecten van de injectie en de kenmerken van de muizen wordt geïnjecteerd.
Het minimaliseren trauma aan de baarmoeder en vruchtwater membranen is het belangrijkste technische aspect van dit protocol. Sharp zal klein kaliber pipetten resulteren in een minimale baarmoeder trauma tijdens de injectie. Wij raden het gebruik van standaard injectie naalden als het kaliber van geprefabriceerde naalden is te groot en zou resulteren in een groot gat in de baarmoeder. Handgemaakte glazen injectie pipetten zijn de enige klein kaliber naalden die gebruikt kunnen worden voor in utero injecties. Een zorgvuldige en nauwgezette chirurgische techniek, waaronder voorzichtige behandeling van de baarmoeder en een korte verdoving is ook van cruciaal belang voor een optimaal resultaat.
Specifieke kenmerken van de ontvanger muizen, zoals de genetische achtergrond, zwangerschapsduur, en de worpgrootte kunnen ook invloed op de overleving. Bepaalde stammen van muizen zijn meer vatbaar voor vroegtijdige arbeid en verlies van zwangerschap, afhankelijk van hun genetische achtergrond. 15 Transgene dieren met gespierde of neurodegeneratieve defecten kunnen een verminderd vermogen om foetussen te leveren vaginaal na het ondergaan van een middellijn laparotomie hebben. 8 Deze zwangere vrouwen kunnen de levering te verlangen keizersnede. We hebben ook vastgesteld dat de zwangerschapsduur op het moment van injectie kan levensvatbaarheid impact. Foetussen die jonger zijn dan embryonale dag 12 hebben lagere tarieven te overleven dan oudere foetussen. Tot slot hebben we vastgesteld dat grote nest maten (> 10 foetussen) hebben de neiging om hogere tarieven van foetaal overlijden na de injectie hebben. Aandacht voor zowel de technische aspecten van deze techniek en de specifieke kenmerken van de muizen wordt geïnjecteerd kan de overleving van de geïnjecteerde foetussen te maximaliseren.
ve_content "> Wanneer deze methodes correct worden uitgevoerd, kan men verwachten dat alle foetussen worden blootgesteld aan het geïnjecteerde materiaal. Net als bij de postnatale setting, echter de succesvolle oplevering van cellen of virussen in utero niet altijd tot donorcel aanslaan of gen uitdrukking, respectievelijk. De innesteling van stamcellen, bijvoorbeeld, is afhankelijk van verschillende factoren zoals de dosering en de bron van de getransplanteerde cellen. Ook het succes van de virale transductie is, voor een deel bepaald door de aard van de virale vector gebruikt. Men moet begrijpen de vele factoren die van invloed zijn overleving van de jongen, cellulaire implantatie, en virale transductie naar succes met dit protocol te bereiken.
Figuur 1. Diagram beeltenis van de juiste verscherping van de injectie pipetten (Stap 1.4)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Meer dan 50 jaar geleden, Billingham, Brent, en Medawar worden gebruikt in de baarmoeder transplantatie in muizen om immuun tolerantie voor vreemde eiwitten te induceren. 16 Sinds die tijd zijn er verschillende varianten van deze techniek is gebruikt om de vragen in de immunologie en stamcelbiologie adres.
Het protocol hier beschreven is een van de meest toegankelijke methoden voor het IUT. De foetale lever biedt een gemakkelijk doelwit gevisualiseerd en biedt toegang tot...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
We willen onze financiering bronvermelding: Het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde Klinische Fellow Training Grant (AN), National Science Foundation (MW), Irene Perstein Award (TCM), American College of Surgeons (TCM), American Pediatric Chirurgische Association ( TCM), en de March of Dimes (TCM).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Pipetten | Kimble Chase | 71900-100 | |
| Pipetttrekker | Sutter Instrument Co. | Model P-30 | |
| Micro-injector | Narishige International | IM-300 | |
| Pipetslijper | Sutter Instrument Co. | Model BV-10 |
Referenties
- Flake, A. W. Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow. N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).
- Wengler, G. S. In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI). Lancet. 348, 1484-1487 (1996).
- Flake, A. W., Zanjani, E. D. in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers. Blood. 94, 2179-2191 (1999).
- Merianos, D. J. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).
- Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation. Blood. 109, 1331-1333 (2007).
- Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice. J Surg Res. 77, 1-5 (1998).
- Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras. Blood. 112, 5245-5253 (2008).
- Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice. J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).
- Hayashi, S. Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy. Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).
- Bouchard, S. Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice. J Gene Med. 5, 941-950 (2003).
- Meza, N. W. Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme. Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).
- MacKenzie, T. C. Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes. Mol Ther. 6, 349-358 (2002).
- MacKenzie, T. C. Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors. J Gene Med. 7, 50-58 (2005).
- Sabatino, D. E. Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice. Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).
- Mellor, A. L., Munn, D. H. Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression. Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172, 603-606 (1953).
- Endo, M. Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector. Mol Ther. 15, 579-587 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer. Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
