Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo's voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Samenvatting

We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo's voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.

Samenvatting

Voor vele doeleinden, de teelt van muizenembryo's ex vivo als organotypische plakken is wenselijk. Bijvoorbeeld, gebruiken we een transgene muis lijn (tauGFP), waarin de uitgebreide versie van het groen fluorescerend eiwit (EGFP) uitsluitend wordt uitgedrukt in alle neuronen van de ontwikkelingslanden centraal en perifeer zenuwstelsel ^1, waardoor de mogelijkheid om zowel film als de innervatie van de voorpoot en om dit proces te manipuleren met farmacologische en genetische technieken ^2. De meest kritische parameter in de succesvolle teelt van dergelijke slice culturen is de methode waarmee de schijfjes worden bereid. Na uitgebreide testen van een verscheidenheid aan methoden, we hebben ontdekt dat een vibratome is de best mogelijke apparaat om de embryo's zodanig dat ze routinematig resulteren in een cultuur die levensvatbaarheid over een periode van enkele dagen, en vooral laat zien slice, ontwikkelt zich in een tijdperk -specifieke manier. Voor mid-zwangerschap embryo's omvat dit de normale uitgroei van de spinale zenuwen uit het ruggenmerg en de achterwortelganglia om hun doelen in de periferie en de juiste bepaling van de skelet-en spierweefsel.

In dit werk, presenteren we een methode voor het verwerken van hele embryo's van embryonale dag (E) E10 tot E12 in 300 tot 400 micrometer plakjes voor de teelt in een standaard weefselkweek incubator, die kunnen worden bestudeerd voor tot twee dagen na de slice voorbereiding. Cruciaal voor het succes van deze aanpak is het gebruik van een vibratome aan elk agarose-embedded embryo slice. Dit wordt gevolgd door de teelt van de schijfjes op Millicell cultuur membraan inserts geplaatst op een klein volume van het medium, wat resulteert in een interface cultuur techniek. Een nest met een gemiddelde van 7 embryo's produceert gewoonlijk minstens 14 sneetjes (2-3 plakjes van de voorpoot regio per embryo), die een beetje varieert vanwege de ouderdom van de embryo's en aan de dikte van de plakken. Ongeveer 80% van de gekweekte plakjes tonen zenuw uitgroei, die kan worden gemeten througout het kweken periode ^2. Representatieve resultaten met behulp van de muis tauGFP lijn worden gedemonstreerd.

Protocol

Deel 1: Voorbereiding voor het snijden en het kweken.

1. Bereid 10-cm weefselkweek platen met het snijden van medium (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% foetaal runderserum, 0,5% glucose, 1 mM glutamine, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) en 3-cm Millicell-CM 0.4-um cultuur membraan inserts en in de broedstoof bij 37 ° C te houden en 5% CO _2.
2. Verwarm 4% een laag smeltpunt agarose in PBS in de magnetron en houdt het bij verhitting plaat, zodat het blijft op ongeveer 37 ° C.
3. Vul 10-cm bacteriologische Petrischalen met PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mm KH ₂ PO ₄₎ en leg ze op ijs.
4. Stel microtoom koeling of ervoor te zorgen dat de buffer lade en koelelementen worden opgeslagen in de vriezer om pre-cool is.

Deel 2: Embryo inbedding.

1. Ontleden embryo uit de baarmoeder en bekijk je ze met een omgekeerde fluorescentie microscoop om te controleren of GFP expressie.
2. Plaats embryo's op een omgekeerde 10-cm petrischaal en oriënteren ze met behulp van Whatman papier strips te veel PBS te verwijderen.
3. Van toepassing zijn op de embryo agarose op te lossen in deze positie. Laat agarose stollen.
4. Beperk de omgeving van het embryo door te snijden met een scheermesje.
5. Draai de embedded embryo op zijn andere kant.
6. Toe te passen extra agarose op embryonaal weefsel om ervoor te zorgen dat het embryo volledig is ingebed.
7. Bereid agarose blok met schone randen en monteren op vibratome chuck met Loctite 406, een speciale lijm gelijkaardig aan "Krazy Glue".

Deel 3: Fineersnijmachine procedure.

1. Stel de voorgekoeld buffer lade en het koelelement.
2. Plaats de boorkop met de gelijmde weefsel en voeg 1x HBSS (Ca ^{2 +-Mg 2 +-vrij} HBSS, 10 mM HEPES buffer pH 7,3, 500 U / ml penicilline / streptomycine) tot gedekt.
3. Invoegen en vast een voorgereinigde (70% ethanol) microtoom mes.
4. Bereid 350 tot 450 micrometer plakjes en breng ze met behulp van verkorte glas pasteurpipetten in weefselkweek platen bewaard op ijs.
5. Met behulp van een tang, verwijder voorzichtig agarose uit elke plak en overdracht van cultuur membranen Millicell. Ongeveer 4 plakjes kunnen worden gekweekt op een membraan in een 10-cm weefselkweek plaat gevuld met 6 ml kweekmedium.
6. Incubeer plakken bij 37 ° C en 5% CO ₂ (Cultuur medium: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% foetaal runderserum, 0,5% glucose, 1 mM glutamine, 2,5 mM HEPES, pH 7,3). Als men voert time-lapse imaging serie een moet houden van het volume van het medium constant. In het geval van getimede imaging-serie voor een korte tijd is het voldoende om het medium te laten zoals het is. Voor langere periodes cultuur verandert na 12-20 uur wordt aanbevolen.

Deel 4: Imaging spinale zenuw uitgroei aan de microscoop.

1. Afbeelding spinale zenuwen het plaatsen van een 10-cm weefselkweek plaat, met daarin Millicell cultuur membranen met plakjes, onder een rechte fluorescentiemicroscoop.
2. Het etiket van de oriëntatie van Millicell cultuur membranen op microscoop podium om de juiste positie in de komende beeldvorming tijdstip.
3. Afbeelding spinale zenuw uitgroei met 4x (numerieke lensopening [NA] 0,1), 10x (NA 0.3) of 20x (NA 0,5) doelstellingen.

Figuur 1 toont een imaging-serie afbeeldingen van de spinale zenuw uitgroei tijdens de 20 uur van de cultuur met 4x en 10x doelstellingen.

Figuur 1 Imaging serie van spinale zenuw uitgroei in een transversale slice van een homozygote tauGPF embryo. * = Motorische neuronen van de ventrale ruggenmerg, pijl = DRG. De dorsale (D)-buik (V) as van het schijfje wordt aangegeven. Scalebars: 200 pm.

Discussie

In een uitgebreide vergelijking van methoden voor het embryonale slice culturen van mid-dracht muis embryo's (E10 - E12) voor te bereiden, hebben we vastgesteld dat een vibratome produceert zonder twijfel de meest betrouwbare resultaten met betrekking tot zowel de algemene leefbaarheid van de culturen en de reproduceerbaarheid van de zenuw uitgroei patronen. In tegenstelling, plakjes bereid met behulp van een tissue McIlwain chopper ³ bleek te zijn volledig inviable. We oorspronkelijk in dienst een guillo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HBSS 10x	GIBCO, by Life Technologies	14180
Dissectie-instrumenten	Fine Science Tools	diverse
L.M.P. agarose	Invitrogen	15517-022
Whatman-papier	Whatman, GE Healthcare	3030917
Verkorte vuurgepolijste pipetten
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	41966
FBS	GIBCO, by Life Technologies	10270-106
Pen Strep	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-glutamine 100x	GIBCO, by Life Technologies	25030
Vibratoom	Microm International	HM 650 V
Fluorescentiemicroscoop	Olympus Corporation	BX61WI
analySIS	Soft Imaging System
Millicell-CM inserts	EMD Millipore	PICMORG 50
10 cm kweekplaten	Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406	Henkel Corp	142580
Scheermesjes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	geen
Dissectiemicroscoop	Nikon Instruments	SMZ800
HEPES	Carl Roth Gmbh	9105.2
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
x4 objectief	Olympus Corporation	PL serie
x10 objectief	Olympus Corporation	UPLFL –PH serie
Filter	Olympus Corporation	U-MNIBA2
CCD-camera	Soft Imaging System	SIS F-View II
Apparatuur voor verwarmde kamer	Leica Microsystems	CTI-Controller 3700 en incubator S #11531171