Dit is een demonstratie van hoe biologische membranen kan worden begrepen het gebruik van elektrische modellen. We tonen ook aan procedures voor de registratie actiepotentialen uit het ventrale zenuw snoer van de rivierkreeft voor student-georiënteerde laboratoria.
Methodenartikel
Modelleren van biologische membranen met Circuit Boards en meten van elektrische signalen in Axonen: Student Laboratorium Oefeningen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit is een demonstratie van hoe elektrische modellen kunnen worden gebruikt om biologische membranen te karakteriseren. Deze oefening introduceert ook biofysische gebruikte terminologie in de elektrofysiologie. Dezelfde apparatuur wordt gebruikt in de membraan-model als op live-preparaten. Enkele eigenschappen van een geïsoleerde zenuw koord zijn onderzocht: zenuw actiepotentialen, werving van neuronen, en de alertheid van de zenuw koord aan omgevingsfactoren.
Protocol
1. INLEIDING
1.1) Achtergrond
Een fundamentele kennis van elektrische circuits is een waardevol hulpmiddel voor het begrijpen en conceptualiseren van vele aspecten van fysiologisch onderzoek en theorie. Deze oefening is bedoeld om u vertrouwd te maken met enkele algemene principes met betrekking tot spanningsbronnen, elektrische weerstand en elektrische capaciteit. Deze inleidende concepten vormen de achtergrond voor het begrijpen van verschijnselen zoals synaptische transmissie en de verspreiding van elektrische signalen langs een zenuwvezel.
Een woord van waarschuwing: In standaard elektrische schakelingen uit het dagelijks leven, opgebouwd uit metalen draden en weerstanden, wordt STROOM gedragen door elektronen, die een negatieve lading hebben. In biologische systemen wordt stroom gedragen door IONEN, die één of meer positieve of negatieve ladingen kunnen hebben. Per conventie stroomt de stroom van positief naar negatief (hoewel elektronen uiteraard daadwerkelijk de andere kant op bewegen).
De componenten van het circuit vertegenwoordigen de elektrische eigenschappen van levend weefsel en in sommige gevallen ook die van niet-levende objecten (zoals elektroden) die betrokken zijn bij het onderzoek.
Maak tijdens het uitvoeren van de oefening aantekeningen van de resultaten en berekeningen.
1,2) Algemene beginselen
De basis eigenschappen van elektrische circuits waarin gelijkstroom vloeit, worden beschreven door de wet van Ohm
V = IR
Waarbij V = spanning in volt (V)
I = stroom in ampère (A)
R = weerstand in ohm (Ω)
Deze wet beschrijft de potentialen die worden waargenomen in zenuwcellen met elektroden. We zullen eerst de wet van Ohm en de toepassing ervan in biologische materialen demonstreren.
1.3) Materialen
| Item | Aantal |
| Breadboard | 1 |
| Weerstanden: 330 K Ω | 1 |
| : 100 K Ω | 12 |
| : 33 K Ω | 6 |
| : 22 K Ω | 1 |
| : 10 K Ω | 6 |
| : 4.7 K Ω | 1 |
| : 2.2 K Ω | 1 |
| : 1.5 K Ω | 1 |
| : 1 K Ω | 1 |
| : 510 Ω | 1 |
| : 330 Ω | 1 |
| : 220 Ω | 1 |
| : 150 Ω | 1 |
| : 100 Ω | 1 |
| Condensatoren: 0,1 μF | 6 |
| : 10 μF | 6 |
| Draden | 12 |
| PowerLab | 1 |
| PowerLab-uitgangsleidingen | 1 |
| PowerLab-ingangsleidingen | 1 |
| Voltmeter (geschikt voor stroommeting) | 1 |
Sleutel voor weerstandscodering
| Kleur | Cijfer |
| Zwart | 0 |
| Bruingrijs | 1 |
| Rood | 2 |
| Oranje | 3 |
| Geel | 4 |
| Groen | 5 |
| Blauw | 6 |
| Violet | 7 |
| Grijs | 8 |
| Wit | 9 |
| Staal | 10% tolerantie |
| Goud | 5% tolerantie |
1e band – 1e cijfer
2e band – 2e cijfer
3e band – Aantal nullen
4e band – Tolerantie
Figuur 1: Systeemopstelling. Computer, breadboard en powerlab met uitgangsstimulator.
Het PowerLab-systeem (PowerLab-interface van AD Instruments, Australië) zal dienen als spanningsbron in dit experiment. Sluit de USB-kabel van het PowerLab aan op de computer, zet het PowerLab aan en open het LabChart-programma vanaf het bureaublad. Selecteer "Nieuw bestand". Er verschijnt een venster met meerdere opnamekanalen. Selecteer bovenaan "Instellen" en klik op "Kanaalinstellingen". In de linkerbenedenhoek van het venster verlaag het aantal kanalen naar 1; op kanaal 1 stel het bereik in op 5 V. Sluit de stimulatorkabel met de twee mini-haakverbindingen aan op de uitgangspoorten van het PowerLab: bevestig de rode verbindingskabel aan de positieve uitgangspoort en de zwarte verbindingskabel aan de negatieve uitgangspoort. Vervolgens moet de uitgangsvermogen, frequentie en pulsduur van het PowerLab worden aangepast. Om dit te doen, selecteer "Instellen" en vervolgens "Stimulatiepaneel". Voor het eerste deel van het experiment zijn lange pulsen van 1,5 V vereist, stel daarom de amplitude in op 0,75 V; dit levert een bereik van 1,5 V op (het PowerLab zal een spanning uitzenden die fluctueert tussen +0,75 V en -0,75 V). Stel de frequentie (0,5 Hz) en de pulsduur (1 s) in.
Figuur 2: Schematische weergave van een breadboard. De gekleurde stroken langs de zijkanten zijn elk als één eenheid verbonden voor een bepaalde kleur. De 2 horizontale kolommen in het midden zijn per helft met elkaar verbonden voor een bepaalde rij, maar maken geen verbinding over de middellijn of met de zijstroken. Elke rij in het midden is onafhankelijk van de volgende rij.
Bij het gebruik van een breadboard zijn er aan beide zijkanten twee kolommen die worden gebruikt voor de ingangs- en uitgangsdraden. Positief wordt over het algemeen verbonden met de rechter positieve kolom, waarbij alle aansluitpunten in de kolom met elkaar zijn verbonden. Negatieve ingang is verbonden met de tegenoverliggende zijde van het breadboard, waar opnieuw alle aansluitpunten in een kolom met elkaar zijn verbonden. In het midden, tussen de twee reeksen kolommen, bevinden zich meerdere rijen van vijf cellen, waarvan elk onafhankelijk is van de andere. Alle cellen in een rij van vijf zijn met elkaar verbonden, maar geïsoleerd van andere rijen. Raadpleeg figuur 2. De gemarkeerde gebieden tonen welke delen van het breadboard met elkaar zijn verbonden. Een nuttige video over het gebruik van een breadboard is online beschikbaar op http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related
Oefening 1
Gebruik de wet van Ohm om de STROOM te berekenen die door het volgende circuit loopt:
Stroom (Netwerk 1): ________________A
Oefening 2
Meet de spanning over de weerstand, de weerstandswaarde van de weerstand, en de stroom die door het bovenstaande circuit (Netwerk 1) loopt.
Figuur 3: Wavetek Meterman voltmeter.
Reconstrueer Netwerk 1 op de breadboard met behulp van een 1500 Ω weerstand; de PowerLab dient als spanningsbron (1,5 V). Metingen van spanning, stroom en weerstand worden uitgevoerd met de Voltmeter. Om nauwkeurige gegevens te verkrijgen, moeten zowel de rode als de zwarte meetpunten van de Voltmeter contact maken met blote draad in de schakeling. Daarnaast moet de schakelaar worden ingesteld op gelijkspanning (DC) binnen een bereik dat geschikt is voor de schaal van de individuele experimentele opstelling. Voor de spanningsmeting, houd beide meetpunten van de Voltmeter tegen de twee uiteinden van de weerstand. Bij het meten van de weerstand van de weerstand (niet de spanningsval), ONTKOPPEL de spanningsbron en houd opnieuw beide meetpunten tegen de weerstand. Om stroom te meten, moet de Voltmeter IN SERIE in de schakeling worden opgenomen; let erop dat de rode en zwarte meetpunten correct zijn georiënteerd ten opzichte van de stroomrichting.
Spanning (Netwerk 1): ________________V
Weerstand (Netwerk 1): ________________Ω
Stroom (Netwerk 1): ________________A
Meet nu met de Power Lab de spanning over netwerk 2 (hetzelfde als netwerk 1, maar op een breadboard), net zoals u deed met de voltmeter. Koppel de voltmeter los en sluit de aansluitdraden aan voor de spanningsmeetsonde met de rode en zwarte klemmen. Ga vervolgens met de cursor naar "Kanaal 1" (rechterkant van het scherm). Klik en ga naar "ingangsversterker". Klik vervolgens in het vak op de knop "differentieel" en stel het bereik in op 5 V. Klik op "OK" om de wijzigingen op te slaan.
Klik op "Start" (rechtsonder) om gegevens te verzamelen. Men kan op elk moment stoppen om de spanningsafwijkingen te meten. Om de verzamelde spanning te meten, klikt u op "Stop" en gebruikt u de "M"-cursor (linksonder) door deze naar de basislijn te slepen. Gebruik vervolgens de vrije cursor om de top van de spanningsgolf te bereiken en zo de amplitude te meten. Lees het spanningsverschil (ΔV) af en noteer de gegevens op papier. U kunt de resultaten bevestigen met de losstaande voltmeter.
1.4) Weerstand en geleiding in serie
Werkingsprincipe van de spanningsdeler: De spanningsval over de totale weerstand van alle in serie geschakelde weerstanden is gelijk aan de spanning van de bron. De spanning over elke individuele weerstand is afhankelijk van het aandeel dat die weerstand vertegenwoordigt in de totale weerstand. Dus:
Een paar weerstanden verdeelt een spanning in verhouding tot hun individuele weerstanden.
Oefening 3
Bereken de spanningsval over elke weerstand in Netwerk 3. Controleer uw berekeningen door de werkelijke spanning te meten met uw voltmeter en de Power Lab-software, terwijl de 1,5 V-bron is aangesloten.
NETWERK 3. Gebruik de twee hierboven aangegeven weerstanden.
| Berekend: | Gemeten: |
| Spanning (over R1):_______V | Spanning (over R1): ________________V |
| Spanning (over R2):_______V | Spanning (over R2): ________________V |
1,5) Voorbeeld van biologische toepassing:
De verschillende elektrische eigenschappen van het celinterieur en de externe oplossing van een actieve zenuwcel vormen een voorbeeld van een spanningsdeler. Deze biologische stroomkring kan worden onderzocht aan de hand van opnames gedaan met externe elektroden. Het actieve gebied van de zenuwcel, waar ionen binnenkomen, fungeert als een spanningsbron; stroom stroomt vanuit dit gebied langs het celinterieur en keert terug via de externe oplossing. Er is dus een stroomdoorvoer tussen twee punten van het membraan die in potentiaal verschillen, noodzakelijkerwijs dezelfde binnen de vezel als erbuiten; aangezien de weerstand van het interieur groter is dan die van het exterieur, treedt hier de grootste spanningsdaling op.
Beschouw het systeem en zijn equivalente circuit (Figuur 4: A. en B.):
Equivalente schakeling:
Figuur 4: A (boven). Elektrische stroom door een biologisch celmembraan. B (onder). Equivalente elektrische schakeling. De spanningsbron (120 mV) is de transmembraanspanning die wordt opgewekt door het actiepotentiaal van de zenuwcel.
Opmerking: R0 en Ri staan in werkelijkheid in serie (niet parallel) vanwege de positie van de spanningsbron. Een equivalente weergave van het circuit is als volgt:
Figuur 5: Alternatieve equivalente elektrische schakeling voor figuur 4A.
Oefening 4.
Gegeven dat:
Vm, potentiaal over membraan = 120 mV
Ri, weerstand van intern vocht = 106 Ω
R0, weerstand van extern vocht = 104 Ω
Bereken V0, het potentiaal tussen elektroden A en B.
V0: ________________V
Oefening 5.
Gebruik netwerk 4 (zie hieronder) om de potentialen over elke weerstand (R0 en Ri) te meten.
NETWERK 4. Sluit een 4,7 kΩ- en een 10 kΩ-weerstand in serie aan op de 1,5 V-bron:
Meet de spanningen met behulp van uw voltmeter.
Spanning (over R0): ________________ V
Spanning (over Ri): ________________ V
NETWERK 5 : Hetzelfde als Netwerk 4, behalve dat R0 = 1 K Ω
Merk op dat in Netwerk 5 de externe weerstand veel lager is (analoog aan een grote hoeveelheid vocht of inactief weefsel dat de elektroden omzeilt), vandaar het belang van het registreren van zenuwen in lucht of onder isolerende olie, om de externe weerstand te verhogen.
Voltage (over R0): ________________V
Voltage (over Ri): ________________V
1.6) Weerstand en geleidbaarheid in serie en parallel
Voorbeeld van biologische toepassing:
Een goed voorbeeld van weerstanden in serie en parallel is de elektrische configuratie van een chemisch transmitterende synaps. Elektrische transmissie is over de meeste synapsen niet mogelijk vanwege het kortsluitend effect van de synaptische spleet. Merk echter op dat deze kortsluiting waarschijnlijk noodzakelijk is om de ontwikkeling van een groot potentiaalverschil over het presynaptische membraan mogelijk te maken, met als gevolg de afgifte van transmitter.
Figuur 6: Model van elektrochemische stroom door een synaps.
Merk op dat in levend weefsel significante elektrische weerstanden ontstaan aan membranen en in beperkte extracellulaire ruimtes. Relatief grote vloeistofruimtes, zoals het celcytoplasma of de badoplossingen, vertegenwoordigen geen significante weerstanden.
Oefening 6.
Netwerk 6 (zie hierboven en het schakelbord) is een analoog van een chemisch transmitterend synaps. In elektrisch transmitterende synapsen wordt de synaptische spleet (shuntweerstand Rs) weggelaten en stroomt de stroom rechtstreeks van de presynaptische naar de postsynaptische cel via Rm1 en Rm2, en vervolgens over Rm3. De verzwakking van het netwerk kan eenvoudig worden gemeten met verschillende waarden van weerstanden, wat veranderingen in verschillende synapsen illustreert. Sluit uw PowerLab aan met 1,5 V (d.w.z. de 0,75 volt instelling).
- Meet het potentiaalverschil (PD) over elke weerstand in het netwerk zoals aangegeven, met behulp van de multimeter. Noteer de waarden van de weerstanden. Maak speciale aantekening van het PD over Rm3 (het membraan van de postsynaptische cel). Voltage: ________________V
- Vervang de 330 Ω weerstand bij Rs door een 330K Ω weerstand. Meet het PD bij Rm3.
- Vervang nu, terwijl Rs op 330K Ω blijft, de 330K Ω weerstand bij Rm2 door een 33K Ω weerstand. Meet het PD over Rm3. Voltage: ________________V
- Vervang nu, terwijl Rs op 330K Ω en Rm2 op 33K Ω blijven, de 22K Ω weerstand bij Rm1 door een 220 Ω weerstand. Meet het PD over Rm3. Voltage: ________________V
Oefening 7
Een voorbeeld van een serie-parallel weerstandsnetwerk doet zich voor bij de kabeleigenschappen van een zenuw- of spiervezel. De LENGTECONSTANTE van een vezel is de afstand waarover een potentiaalverschil (PD) over het membraan afneemt tot 37% van zijn oorspronkelijke waarde. Deze verzwakking is het gevolg van de interne en externe weerstanden van het vocht aan weerszijden van het membraan, die worden overbrugd door de (relatief hoge) transversale membraanweerstand. De waarde van de weerstand beperkt de signaaloverdracht langs het axon van een zenuwcel. De lengteconstante is 1/e, gemeten bij een exponentiële afname. dE/dT=-E/RC; waarbij E het spanningsverschil is, R de weerstand en C de capaciteit. Of in een andere vorm: E=Eoexp (-t/RC); waarbij Eo de beginwaarde van de spanning is en t de tijd in seconden. RC wordt ook wel tau (τ), de tijdconstante, genoemd.
Aangenomen dat de weerstand van het externe medium verwaarloosbaar is in vergelijking met de intracellulaire en membraanweerstanden, kunnen de passieve resistieve eigenschappen van het membraan worden weergegeven door het volgende circuit:
Figuur 7: Vertaling van Netwerk 7 naar breadboardopstelling.
Pas een voltage toe aan het ene uiteinde van Netwerk 7 tussen A en B. Gebruik een stimulator en selecteer een puls van 1 s duur, 1 V amplitude (ingesteld op 0,5 V) en een frequentie van 0,75 Hz. Sluit de voltmeter achtereenvolgens aan over elke „membraan“-weerstand en noteer het potentiaalverschil (PD) over die weerstand. Houd één uiteinde van de voltmeter-probe vast op (A-lead, rood), terwijl het andere uiteinde achtereenvolgens wordt verplaatst langs de posities 1 t/m 5. Zet elke waarde uit op een grafiek van PD tegen „afstand“ vanaf de bron, waarbij de membraanweerstanden op eenheden afstand van elkaar staan. Bepaal aan de hand van uw grafiek de lengteconstante van deze schakeling. 
Grafiek van de lengteconstante van Netwerk 7: ______________
Het effect van een toename van de transversale membraanweerstand, zoals die zou optreden bij een myelineschede, of een afname van de longitudinale interne weerstand van de vezel in verband met een toename van de vezeldiameter, is een verandering in de lengteconstante. De waarden van de weerstanden komen niet exact overeen met die in een zenuwaxon, maar zijn ongeveer evenredig. Evenzo is de „eenheidsafstand” in het model aanzienlijk opgeblazen ten opzichte van een echte zenuwcel.
1,7) Capaciteit
Condensatoren slaan lading op. Als een spanning via een weerstand op een condensator wordt aangelegd, stroomt er stroom naar de condensator, waardoor het potentiaalverschil (PD) over de condensator exponentieel in de tijd toeneemt tot het PD van de bron; het verloop van deze spanningsverandering is afhankelijk van de aangelegde spanning, de capaciteit en de serieweerstand. Een vergelijkbaar, maar omgekeerd verloop wordt waargenomen wanneer een condensator ontladen wordt.
Sluit de ingang van dit eenvoudige weerstand-condensator (RC)-netwerk aan op uw stimulator, bij A en B. Gebruik 1 V (ingesteld op 0,5 V) pulsen met een duur van 1 s en een frequentie van 0,75 Hz. Stel de opname ook in op 20 K/sec (rechterkant van het bedieningspaneel). Sluit uw ingangsklemmen van de PowerLab aan over de condensator. Verzamel enkele seconden aan gegevens en stop vervolgens. Gebruik het Zoom-venster om de oplooptijd van één van de blokpulsen uit te breiden. Mogelijk moet meerdere keren ingezoomd worden om de trace voldoende te spreiden. Meet de oplooptijd vanaf de basislijn tot het hoogste punt van de spanningscurve, net voordat deze vlak wordt. Observeer het verloop van de potentiaalverandering en de vervorming van de blokpulsen. Observeer het effect van het vervangen van de 10μF-condensator door een van 0,1 μF. Door uw spanningsonderzoeker van de PowerLab over de weerstand aan te sluiten, kunt u het verloop van de stroom door de schakeling observeren. Verzamel slechts enkele pulsen en stop daarna om te meten. Gebruik de „M“-cursor om naar de basislijn vóór de oplooptijd te gaan, en de vrije cursor om naar het punt te gaan waar de spanning begint te stabiliseren.
Het laatste voorbeeld omvat zowel resistieve als capacitieve componenten. De passieve kabel-eigenschappen van zenuw- en spiervezels worden bepaald door soortgelijke elementen, die voortkomen uit de eigenschappen van het celmembraan. Niet alleen is er een dwarsmembraanweerstand aanwezig in de cel, maar ook een membraancapaciteit, als gevolg van de elektrische eigenschappen van het celmembraan. Het effect hiervan is dat het tijdverloop beïnvloedt van de ontwikkeling van electrotonisch verspreide potentialen.
Voorbeeld:
Dit netwerk kan worden opgebouwd uit Netwerk 7 door de benodigde condensatoren parallel aan de membraanweerstanden (Rm) aan te sluiten.
Oefening 8.
Sluit op netwerk 7 de 10 μF-condensatoren aan. Gebruik 1 s, 1 V (0,5 V-instelling) en 0,75 Hz-pulsen van de stimulator, die verbonden moet zijn op A en B, en observeer de potentiaalveranderingen over elke membraanweerstand. Ga ervan uit dat de „drempel”-spanning (de spanning waarbij een actiepotentiaal in een zenuwcel wordt opgewekt) 0,2 V bedraagt, en meet de tijd die nodig is om de drempelspanning te bereiken bij elke membraanweerstand. Hier betekent drempel de potentiaalwaarde waarbij een actiepotentiaal in een levende cel kan worden opgewekt. Zet uw resultaten uit als tijd tegen ‘afstand’.
Figuur 8: Vertaling van Netwerk 9 naar opstelling op breadboard.
Grafiek voor Figuur 8.
Simuleer het effect van een afname van de membraancapaciteit veroorzaakt door een toename van de dikte van de myelineschede door over te schakelen op de kleinere condensatoren van 0,1 µF. Let op de verandering in de tijd die nodig is om de drempelwaarde te bereiken bij een geselecteerde weerstand. Plaats de gegevens boven op dezelfde grafiek met de grotere condensatoren op hun plaats.
Wat betreft een spiermembraan kan men denken aan een verhoogde capaciteit als gevolg van een toename van het membraanoppervlak door de daarmee verbonden T-tubuli, wat resulteert in een grotere membraancapaciteit in vergelijking met een neuron. Kleinere condensatoren kunnen worden gebruikt om de verlaagde capaciteit te illustreren die ontstaat door toevoeging van myeline aan een niet-gemylineerd zenuwaxon. Het belangrijkste leerpunt hier is dat de elektrische capaciteit evenredig is met het oppervlak, en omgekeerd evenredig met de dikte van de diëlektrische laag (myeline) die de „platen” of opslagoppervlakken van de condensator scheidt.
De eigenschappen die worden gepresenteerd op een modelcircuit, worden ook waargenomen in levende preparaten. Cellen verschillen echter in eigenschappen zoals lekstromen over het membraan en axiale weerstand. Sommige cellen genereren geen actiepotentialen. Een actiepotentiaal wordt echter opgewekt wanneer een signaal moet worden overgebracht over enkele millimeters, omdat de passieve elektrische eigenschappen van cellen signalen verzwakken over afstanden van enkele millimeters. In de volgende reeks experimenten wordt de registratie van actiepotentialen gedemonstreerd.
1.8) Vragen voor de studenten
- Wat zijn enkele normale waarden van de lengteconstante voor neuronen en spiercellen?
- Wat gebeurt er als een membraan een lage membraanweerstand heeft: zou de tijdsconstante (tijd om 63% van de eindwaarde te bereiken) dan veranderen? Zo ja, hoe zou deze veranderen bij een lagere membraanweerstand? Wat is de algemene wiskundige formule voor de tijdsconstante (tau)?
- Waarom kunnen grotere axonen, zoals de reusachtige axon van de inktvis, elektrische signalen sneller geleiden dan kleinere axonen in dezelfde inktvispreparatie?
2. GELEIDINGSEIGENSCHAPPEN VAN ZENUWCELLEN
2.1) Van een broodplank naar levende cellen
De passieve eigenschappen die worden gedemonstreerd in de oefeningen met de printplaat zijn ook meetbaar in levende cellen; echter, deze passieve eigenschappen kunnen gecompliceerd zijn om te isoleren wanneer ze gepaard gaan met actiepotentialen in zenuwcellen. De actieve eigenschappen van de neuron zijn het vermogen om een rustmembraanpotentiaal te handhaven, actiepotentialen te genereren en deze langs een stuk membraan te regenereren.
Elektrische stroom door een zenuwkanaal kan ook regeneratief zijn binnen individuele neuronen en van het ene naar het volgende neuron. In het zenuwkanaal aan de ventrale kant van de rivierkreeft (VNC) communiceren sommige neuronen via septale (dwz. gap-)verbindingen. Zoals aangetoond in eerdere oefeningen met de breadboard, kan het veranderen van de weerstand geleiding van elektrische signalen belemmeren. Dit is vergelijkbaar met het veranderen van de stroom van stroom door gap-verbindingen binnen het ventrale zenuwkanaal.
De geleidingsnelheid en andere eigenschappen van het samengestelde actiepotentiaal in het VNC worden onderzocht in de volgende reeks experimenten. We zullen demonstreren hoe het VNC kan worden verkregen voor experimenteel onderzoek en hoe de responsen kunnen worden opgewekt en gemeten met behulp van standaardapparatuur die is ontworpen voor het onderwijs in studentenlaboratoria.
2.2) De rivierkreefbereiding
De kreeft ventrale zenuwkoord is het meest geschikt voor dit experiment. De zenuw is gemakkelijk te dissekeren en er kunnen diverse protocollen worden gebruikt die de geleiding beïnvloeden, in combinatie met deze preparatie. Voordat u dit experiment begint, maak dan vertrouwd met de onderstaande anatomische termen van de kreeft:
Figuur 9. Algemeen anatomisch diagram van de kreeft.
Gewijzigd van: http://www.enchantedlearning.com
2.3) Achtergrondinformatie over geleiding in een zenuw
Het zenuwstelsel van de rivierkreeft in het ventrale zenuwkoord zorgt voor het doorgeven van signalen die vluchtreacties, zoals de staartklapreactie, initiëren. Voor dit experiment worden opnames gemaakt van het volledige intacte zenuwkoord. De individuele actiepotentialen van elke neuron binnen het zenuwkoord worden opgeteld tot een samengestelde actiepotentiaal, die de meetbare elektrische pulsen oplevert die zichtbaar zijn in de opnamesoftware. Erlanger, Gasser en Bishop (1924) behoren tot de pioniers die samengestelde actiepotentialen hebben beschreven. Getoond worden kenmerken van de refractaire periode, geleidingsnelheid en de neurale effecten van de gap-junctieremmer 1-heptanol of temperatuur. Het leren kennen van de basisprincipes van zenuwcelsignalen draagt bij tot een beter begrip van de algemene werking van het zenuwstelsel (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe en Grundfest, 1961).
2.4) Materialen
| Artikel | Aantal |
| Grote rivierkreeft (Procambarus clarkii) | 1 |
| Precisiesnijdschaar | 1 |
| Forceps | 1 |
| MLT016/X zenuwkamer | 1 |
| Laptop met Scope-software | 1 |
| PowerLab | 1 |
| PowerLab-versterker | 1 |
| Stimulator-uitgangskabel voor PowerLab | 1 |
| USB PowerLab/computerconnector | 1 |
| Manipulatorstandaard met zuigelektrode | 1 |
| Glaspipet met knijper | 1 |
| Beker met rivierkreeftsaline | 1 |
2.5) Methoden
2.5.1) Dissectie
Zorg ervoor dat de zenuwschaal, diverse instrumenten en oplossingen zijn voorbereid voordat u een rivierkreeft gaat dissekeren.
- Wikkel de rivierkreeft in een vochtige papieren doek om vast te houden, of houd de rivierkreeft met één hand vast, waarbij de scharen (chelipeden) tussen duim en wijsvinger zitten.
- Maak met de andere hand met een schaar een insnijding door het rostrum tussen de oogsokkels.
- Snijd vanaf de insnijding naar beneden totdat het hoofd volledig is afgescheiden.
- Maak een insnijding aan de basis van het cephalothorax boven de buik; verwijder de staart. (Indien nodig kunnen de scharen en looppoten worden verwijderd om dit proces te vergemakkelijken.)
- Verwijder de zwemmerets.
- Maak een insnijding langs beide zijden van de ventrale kant van de buik. Wees voorzichtig om diepere weefsels niet te beschadigen.
- Trek het losgemaakte deel van het exoskelet naar achteren tot aan de basis van het staartventiel om de ventrale zenuwstreng bloot te leggen.
- Verwijder met de rand van de pincet voorzichtig de ventrale zenuwstreng aan de punt. Wees voorzichtig om de zenuwstreng niet te rekken of te verpletteren. (Elke opvallende knobbels op de zenuwstreng zijn ganglia van de rivierkreeft.)
- Leg de zenuwstreng uit over de metalen staven in de zenuwkamer. Het is van essentieel belang om de ventrale zenuwstreng vochtig te houden. Voeg hiervoor zoveel rivierkreeftzoutoplossing toe aan de zenuwkamer dat de vloeistof op dezelfde hoogte komt als de metalen dwarsstaven. Pipetteer vervolgens zoveel van de rivierkreeftzoutoplossing weg dat het vloeistofniveau net de onderkant van de staven raakt.
Rivierkreeftzoutoplossing (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl2.2H2O; 2.45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES afgesteld op pH 7.4) - Als de zenuw op zijn plaats ligt, bevestig dan de stimulatorkabel met de twee minihook-aansluitingen aan de zenuwkamer. Bevestig de positieve rode aansluiting aan een van de externe metalen lussen aan het uiteinde van de zenuwstreng; bevestig de negatieve zwarte aansluiting aan de dichtstbijzijnde aangrenzende metalen lus die nog in contact staat met de zenuwstreng.
- Plaats de zuigelektrode in de manipulator dicht bij het tegenoverliggende uiteinde van de zenuw.
- Zuig de punt van de ventrale zenuwstreng voorzichtig in de opname-elektrode.
2.5.2) Opname
Zodra de punt van het zenuwkanaal in de opname-elektrode is gezogen, zorg ervoor dat de elektrode is bevestigd aan de probe en dat de probe voldoende is geaard. Dit kan eenvoudig worden bereikt door de aardkabel aan de Faraday-kooi te bevestigen. De positieve en negatieve zuigelektrode-draden moeten eveneens worden aangesloten op de overeenkomstige aansluitpunten van de probe. De probe moet worden aangesloten op de differentiaalversterker, die op zijn beurt is verbonden met de PowerLab.
Sluit de elektrische draden van de zuigelektrode aan op de kopstuk. De draden moeten worden aangesloten met rood (plus) linksboven, groen (aarde) in het midden en zwart (min) onderaan. Dit is aangegeven in figuur 10 voor het kopstuk hieronder. De aardedraad kan gewoon in het zoutoplossingsbad worden geplaatst. Dus één draad van de zuigelektrode naar de + ingang en de andere naar de -ingang. Het maakt niet uit welke draad van de zuigelektrode naar de + of - ingang gaat.
Figuur 10: Ingangen voor de hoofdfase
De instellingen voor de versterker zijn als volgt:
| BEDIENING | INSTELLING |
| Hoogdoorlaatfilter | DC |
| Filterspoel | UIT |
| Laagdoorlaatfilter | 20kHz |
| Capaciteitscompensatie | Tegen de klok in |
| DC-offset fijn- en grofregeling | Tegen de klok in |
| DC-offset (+UIT) | UIT |
| Versterkingsregelaar | 50 |
| Ingang (DIFF MONO GND) | DIFF |
| MODUS (STIM-GATE-REC) | GATE |
| ΩTEST | UIT |
Sluit de meegeleverde USB-kabel aan op de achterkant van de PowerLab en op de computeraansluiting. Open de Scope-software op het bureaublad van de computer. Selecteer rechtsboven op het scherm 'Kanaal 2' en schakel dit uit. Pas het scherm aan zodat alleen kanaal 1 zichtbaar is, door de schuifbalk in het midden van het scherm helemaal naar beneden te verplaatsen. Klik vervolgens rechtsboven op het scherm op de 'Ingangsversterker' voor kanaal 1. Selecteer het volgende:
| BEDIENING | INSTELLING |
| BEREIK | 500 mV |
| AC | AANGEVINKT |
| LAAGDOORGANG | UIT |
| ENKELVLEUGEL | AANGEVINKT |
| OMKEREN | AANGEVINKT |
Klik vervolgens opnieuw onder "Instellen" op "Bemonstering." Selecteer in het vak met de titel "Sweep" op het scherm dat verschijnt het volgende:
| BEDIENING | INSTELLING |
| MODUS | MEERVOUDIG |
| MONSTER | 100 SCANBEGINSLEUNEN |
| BRON | GEBRUIKER |
| VERTRAGING | 0 SECONDE |
Selecteer ten slotte in het tabblad "Set up" de optie "Stimulator". Klik op het vakje om "Isolated Stim" uit te schakelen. Kies de volgende instellingen:
| BEDIENING | INSTELLING |
| MODUS | MEERVOUDIG |
| VERTRAGING | 5 ms |
| DUUR | 1 ms |
| PULS(SEN) | 2 |
| INTERVAL | 15 ms |
| BEREIK | 5 V |
| AMPLITUDE | 0.5 |
Zie „Tijdbasis“ in het rechterpaneel. Wijzig „Sample“ in 1024 en „Time“ in 200 msec.
Figuur 11: Twee samengestelde actiepotentialen met een interval van 15 msec tussen stimuli, geregistreerd met de Scope-software.
Oefening 1.
Selecteer de knop "Start" linksonder op het scherm. Met de bovenstaande instellingen, moet er een duidelijk gedefinieerd samengesteld actiepotentiaal zichtbaar worden in het gegevensverzamelvenster van Scope (Figuur 11). Schets de algemene vorm van het actiepotentiaal in de grafiek hieronder (Figuur 12):
Figuur 12: Lege grafiek om de vorm van het samengestelde actiepotentiaal te schetsen.
Verminder langzaam de spanning met behulp van het tabblad linksboven op het scherm. Het actiepotentiaal zou kleiner moeten worden in grootte totdat het karakteristieke golfpatroon eveneens verdwijnt. Door de spanning te verlagen, wordt het aantal zenuwcellen dat wordt gerecruteerd om het samengesteld actiepotentiaal af te vuren, verminderd. De grotere axonen worden waarschijnlijk als eerste gerecruteerd bij lagere spanningen en zijn de sneller geleidende exemplaren, die daarom eerst zichtbaar zouden zijn in het samengesteld actiepotentiaal. Verhoog de spanning trapsgewijs om het tegengestelde effect te observeren; naarmate meer zenuwcellen worden gerecruteerd, wordt de golf van het samengesteld actiepotentiaal groter. Deze oefening illustreert het feit dat individuele zenuwcellen verschillende drempels hebben voor de productie van een actiepotentiaal. Wanneer het samengesteld actiepotentiaal niet verder toeneemt bij toenemende stimulerende spanning, zijn alle zenuwcellen gerecruteerd; op het computerscherm zouden twee duidelijke pieken in de golf van het actiepotentiaal zichtbaar moeten zijn.
Oefening 2.
Nadat u de neuronrecrutering en het resulterende samengestelde actiepotentiaal heeft onderzocht, observeert u het effect van de refractaire periode. Dit kan worden gedaan door twee stimuli kort na elkaar te geven en het interstimulusinterval te variëren, en vervolgens te observeren bij welk interstimulusinterval het door de tweede stimulus opgewekte samengestelde actiepotentiaal een kleinere amplitude heeft in vergelijking met het eerste samengestelde actiepotentiaal. Wijzig de vertraging tussen pulsen met behulp van het tabblad in de linkerbovenhoek van het scherm. Verkort de vertraging steeds verder totdat het tweede samengestelde actiepotentiaal niet meer kan worden opgewekt. De tijd tussen pulsen waarbij geen tweede actiepotentiaal meer wordt opgewekt, wordt de absolute refractaire periode genoemd. De tijd tussen het einde van de absolute refractaire periode en het tijdstip waarop een tweede stimulus een actiepotentiaal van volledige amplitude genereert, wordt de relatieve refractaire periode genoemd. Geef een schatting van de absolute en relatieve refractaire periode in de daarvoor bestemde ruimtes.
Absolute refractaire periode: ___________________
Relatieve refractaire periode: ___________________
2.5.3) Meten van geleidingsnelheid
Meet met een millimeterliniaal de afstand tussen de stimuleringsdraad die het dichtst bij de opname-elektrode ligt en de opname-elektrode. Meet aan de hand van de geregistreerde opname de tijd tot de verschillende pieken van de gebeurtenissen in het samengestelde potentiaal, zodat u de geleidingsnelheid van de diverse elektrische signalen kunt vaststellen. Zet de afstand in millimeter om naar meter en de tijd in milliseconde naar seconde, om de eenheid meter per seconde te verkrijgen.
1ste golfvorm geleidingsnelheid: __________________
2de golfvorm geleidingsnelheid: __________________
3de golfvorm geleidingsnelheid: __________________
4de golfvorm geleidingsnelheid: __________________
2.5.4) Manipulatie van de gap junctions en/of geleidingsnelheid
Onderzoek vervolgens de eigenschappen van een neuronale inhibitor. Het ontkoppelende effect van heptanol werd voor het eerst beschreven in gesegmenteerde axonen van rivierkreeft (d.w.z. gap junctions) door Johnston et al. (1980). Dit effect, gerelateerd aan elektrische communicatie, werd al snel bevestigd in diverse gewervelde en ongewervelde systemen (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). Om de rol van elektrische communicatie in dit ventrale zenuwkanaal te begrijpen, kan een zoutoplossing met (1 mM) 1-heptanol worden gebruikt om gap junctions te ontkoppelen. Spoel met behulp van een glazen pipet de gehele zenuwstam met een oplossing van heptanol. Observeer de verandering die wordt geregistreerd door de Scope-opnamesoftware en vat deze samen. (Let op de verandering in de golfvorm en of de geleidingsnelheid van de golfvormen is veranderd.) Als alternatief kan ijskoude zoutoplossing worden gebruikt in plaats van de badoplossing, en kunnen eventuele veranderingen in de golfvorm of de geleidingsnelheid van de golfvormen worden gevolgd.
Discussie
Ons doel in de on-line video-presentatie en dit papier is aan te tonen dat de biofysische eigenschappen van cellen kan, gedeeltelijk, worden gemodelleerd als elektrische circuits. Daarnaast, met live neurale weefsel dat is relatief gemakkelijk te verkrijgen, fundamentele principes van geleidingssnelheid, refractaire perioden en elektrofysiologische opname technieken zijn mogelijk voor undergraduate studenten laboratoria met een bescheiden investering van apparatuur. De thema's en gepresenteerd fundamentele paradigma's kunnen gemakkelijk worden aangepast voor de eisen van de verschillende cursussen.
Onderhoud van rivierkreeft en hun overvloed maakt ze aantrekkelijk modellen voor student-driven experimenteren. Schaaldieren ventrale zenuw kabels zijn over het algemeen robuust en te behouden fysiologische integriteit in een minimale zoutoplossing voor de uren, dat passend is voor een 3 uur student laboratorium.
Gezien het feit dat sommige van de grote axonen in de VNC van de rivierkreeft zijn verbonden via gap junctions, extra experimenten op hun bijdrage kan worden uitgevoerd, en de verschillende eigenschappen dan gevonden in de standaard kikker heupzenuw preparaat kan worden aangetoond. De heupzenuw is een klassiek model voor de aanpak van samengestelde actiepotentialen en geleiding eigenschappen. Het is misschien zelfs een interessant vergelijkend experiment voor studenten om geleiding te vergelijken, axon werving en selectie, en de refractaire periode tussen deze twee preparaten.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Deze experimenten werden gewijzigd van een laboratorium handleiding die is gebruikt in een cursus, georkestreerd door dr. HL Atwood, bij de afdeling Zoölogie, Universiteit van Toronto. De oefeningen werden ook gebruikt en aangepast uit een handleiding die werd geproduceerd voor "6 e INTENSIVE Ibro WORKSHOP OVER BASIC NEUROSCIENCE" en werd gehouden in Korea University, Seoul, Zuid-Korea in 1993 (Cooper et al.., 1993). De huidige wijzigingen waren nodig om apparatuur te gebruiken om gemeenschappelijke dag student gericht laboratoria aanwezig zijn op diverse universiteiten. Ondersteund door de Universiteit van Kentucky, Departement Biologie, Bureau van Undergraduate Studies en College of Arts & Sciences.
Materialen
Printplaat
- Elektronica hieronder voor de breadboard experimenten zijn te verkrijgen op een lokale elektronica winkel zoals Radio Shack.
- Broodplank, weerstanden, condensatoren, batterijen en draden die kunnen dienen als knooppunten voor het breadboard zoals beschreven in de experimenten.
- Een gemeenschappelijke voltmeter (Wavetek METERMAN voltmeter)
- A / D-board voor on-line opname op een computer. Elektrische signalen worden opgenomen op lijn naar een PowerLab/4s interface (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We maken gebruik van standaard software van ADInstruments genaamd Grafiek of Scope.
Fysiologie experimenten
- Rivierkreeft (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biologische Supply Co, Raceland, LA., USA.
- Standaard rivierkreeft zoutoplossing: Aangepast uit de oplossing van Van Harreveld's (1936). (In mm) 205 NaCl, KCl 5,3, 13,5 CaCl 2 2H 2 O; 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES en aangepast aan de pH 7,4. Alle zoutoplossing chemicaliën werden verkregen van Sigma Chemical Company (St. Louis, MO).
- Dissectie-instrumenten: Fijn # 5 pincet, fijne schaar, mes houder, # 26002-20 insect pins (alle verkregen van Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94.404 tot 1139)
- Een zenuw kamer schotel (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA) om de zenuw te houden. De draden die bij de zenuw kamer schaal kan worden gebruikt om de zenuw te stimuleren.
- Een zuig-elektrode wordt gebruikt om de signalen op te nemen.
- De manipulator of een klem op een ring stand zal ook dienen als een houder voor de zuigkracht elektrode.
- Kooi van Faraday
- Ontleden Microscoop
- High Intensity Illuminator (lichtbron)
- Microscoop Platform
- AC / DC differentiële versterker (AM Systems Inc Model 3000)
- PowerLab 26T (AD Instruments)
- Extracellulaire versterker (AD Instruments)
- LabChart 7 (ADI Instruments)
- Ontleden tools
- Een ring staan en klem om te dienen als een houder voor de opname zuig-elektrode
Referenties
- Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6, 305-320 (1991).
- Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling. European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).
- A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).
- Cragg, B. G., Thomas, P. K. The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers. Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).
- Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph. American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).
- Furshpan, E. J., Potter, D. D. Transmission at the giant motor synapses of the crayfish. Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).
- Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. Interaction of anesthetics with electrical synapses. Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).
- Loewenstein, W. R. Permeability of membrane junctions. Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).
- Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase. Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).
- Peracchia, C. Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration. Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).
- Peracchia, C., Dulhunty, A. F. Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling. Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).
- Peracchia, C., Bernardini, G., Peracchia, L. L. Is calmodulin involved in the regulation of gap junction permeability. Pfügers Arch. 399, 152-154 (1983).
- Peracchia, C., Lazrak, A., Peracchia, L. L. Molecular models of channel interaction and gating in gap junctions. Handbook of Membrane Channels. Molecular and Cellular Physiology. Peracchia, C. , Academic Press. San Diego. 361-377 (1994).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. L. Gap junctional conductance is a simple and sensitive function of intracellular pH. Sciences NY. 211, 712-715 (1981).
- Spray, D. C., Harris, L. L., Bennett, M. V. L. Comparison of pH and Ca dependence of gap junctional conductance. Intracellular pH: Its Measurement, Regulation, and Utilization in Cellular Functions. Nuccitelli, R., Deamer, D. , Alan R. Liss. New York. 445-461 (1982).
- Spray, D. C., White, R., De Carvalho, C., Harris, A. L., Bennett, M. L. V. Gating of gap junction channels. Journal of Biophysics. 45, 219-230 (1984).
- Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. Journal of General Physiology. 45, 267-308 (1961).
- Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii. Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen