$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bereiding van reagentia
Bereid voorraad isotone Percoll (SIP), 4 ml per hersenen, door het mengen van 9 delen van Percoll met een deel van de 10X HBSS zonder Ca + + en Mg + +.
Bereid SIP op 70% in 1X HBSS zonder Ca + + en Mg + +, 2 ml per hersenen gedispenseerd in een 15 ml polypropyleen conische buis.
Opmerking: Het is aanbevolen dat Percoll moet worden gebruikt bij kamertemperatuur, als het gebruikt wordt koud, de cellen hebben de neiging te klonteren en cel-scheiding is minder efficiënt.
Tissue verzamelen en homogenisering
Verdoven muizen en perfuseren door middel van de linker ventrikel met ijs-koud 1X HBSS. Ontleden hersenen en het ruggenmerg en in stand houden in RPMI zonder fenol rood tot alle muizen worden opgeofferd.
Plaats weefsels in 7 of 15 ml dounce homogenisator met 3 ml RPMI, voorzichtig een celsuspensie met een loose-fitting pestle (A maat), gevolgd door een Tigh-fitting pestle (B grootte) om verder te distantiëren van de weefsels. Vul het volume van de cel suspensies tot 7 ml met RPMI.
Gradient opgezet
Voeg 3 ml van SIP naar de celsuspensie tot een definitief 30% SIP maken
Langzaam laag van de 10 ml celsuspensie op de top van de 70% SIP. Dit is de meest kritische fase van de procedure, gebruik van een pipet-steun zijn vastgesteld in de zwaartekracht wijze het vermijden van vermenging van de 70% en 30% oplossingen. Een heel duidelijke vlakke lijn moet duidelijk zichtbaar zijn op de 70% -30% kruising.
Centrifugeer 30 min bij 500G 18 ° C. Zorg ervoor dat centrifuge stopt met minimale of geen rem, zodat de interfase niet wordt verstoord.
Met behulp van een overdracht pipet, verwijder voorzichtig de laag van puin uit de top van de buis en verzamel 2.0-3.0 ml van de 70% -30% interfase in een schone conische buis met 8 ml 1X HBSS. Zorg ervoor dat de Percoll met de interfase wordt verdund ongeveer drie keer, een paar keer meng door inversie en centrifugre 7 minuten bij 500G bij 18 ° C.
Resuspendeer pellet in 1 ml van cel verkleuring buffer en overbrengen naar een 1,5 ml buis en wassen nog een keer met behulp van een micro-centrifuge bij 10.000 G 1 min bij 4 ° C.
Antilichaam vlekken
Resuspendeer pellets in 50 ul van gezuiverde antimouse CD16/CD32 verdund 1:200 in cel verkleuring buffer aan het Fc-bindingsplaatsen te blokkeren. Incubeer met ijs gedurende 10 minuten. Tellen cellen met behulp van een hemocytometer.
Voeg 50 ul van antilichamen cocktail mix en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Elk antilichaam moet eerst worden getitreerd tot een optimale verdunning te beoordelen. Gebruik de juiste fluorochroom combinaties gekozen op basis van de mogelijkheden van laser-en filter-instellingen van uw specifieke flowcytometer.
Was de cellen in cel verkleuring buffer, opnieuw in suspensie pellets in 100-200 pi cel verkleuring buffer en analyseren onmiddellijk in de cytometer, of als alternatief cellen kunnen worden gesuspendeerd in 2% paraformaldehyde (PFA), opgesteld in PBS en opgeslagen over-nacht bij 4 ° C .
Representatieve resultaten:
Na het draaien van de hellingen, moet de 70% -30% interfase hebben een bepaalde witte halo, en kwantificering van de cellen hersteld van een naïeve muis moet opleveren 3-5 x10 5 cellen per muis (hersenen plus ruggenmerg). Ontstoken hersenen zou kunnen hebben, variërend aantallen van ontstekingscellen, afhankelijk van het CZS belediging of de ziekte model (figuur 1).
Figuur 1. Isolatie van mononucleaire cellen, van naïef en EAE-hersenbarrière tijdens piek-en vaatziekten. Hersencellen suspensies werden gescheiden dan discontinu 70% / 30% Percoll gradiënten. Cellen gekleurd werden geïncubeerd met Fc-blok, gevolgd door anti-CD45 antilichamen voor 30 min op ijs. Cellen werden gespoeld in cel verkleuring buffer, en gefixeerd in 2% PFA eerdere verwerving in een LSR-II. CD45 intensiteit wordt gemeten in de Y-as, waar drie verschillende populaties worden gevisualiseerd. Verdere karakterisering van het immuunsysteem fenotype van CD45 hi infiltrerende cellen wordt uitgevoerd met behulp van extra antilichamen en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie.