Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyses.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van hersenen en ruggenmerg mononucleaire cellen met behulp van Percoll Verlopen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Isolatie van immuuncellen die het centrale zenuwstelsel (CZS) tijdens infectie, trauma, auto-immuniteit of neurodegeneratie infiltreren, is het vaak nodig om hun fenotype en effector functies te definiëren. Histochemische benaderingen zijn wat belangrijk is voor de locatie van de infiltrerende cellen te bepalen en om de bijbehorende CNS pathologie analyseren. Echter, in-situ histochemie en immunofluorescentie kleuringstechnieken beperkt door het aantal antilichamen die gebruikt kunnen worden in een keer om immuun cel subtypen karakteriseren in een specifiek weefsel. Daarom, histologische benadering in combinatie met immuun-fenotypering door flowcytometrie zijn cruciaal voor het volledig karakteriseren van de samenstelling van de lokale CNS infiltratie. Dit protocol is gebaseerd op de scheiding van CNS cellulaire suspensies meer dan discontinous Percoll gradiënten. Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor de identificatie van verschillende immuun celpopulaties in een enkel monster door flowcytometrie.
Protocol
Bereiding van reagentia
Bereid voorraad isotone Percoll (SIP), 4 ml per hersenen, door het mengen van 9 delen van Percoll met een deel van de 10X HBSS zonder Ca + + en Mg + +.
Bereid SIP op 70% in 1X HBSS zonder Ca + + en Mg + +, 2 ml per hersenen gedispenseerd in een 15 ml polypropyleen conische buis.
Opmerking: Het is aanbevolen dat Percoll moet worden gebruikt bij kamertemperatuur, als het gebruikt wordt koud, de cellen hebben de neiging te klonteren en cel-scheiding is minder efficiënt.
Tissue verzamelen en homogenisering
Ve....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Analyses van celoppervlaktemerkers in het CZS leukocyten uit normale muis ontstoken weefsels zijn gebruikt voor enkele decennia 1-3. Isolatie protocollen zijn gebaseerd op de scheiding van microglia en leukocyten door de dichtheid centrifugeren 4. Hier beschrijven we een snelle en effectieve methode voor het isoleren van CNS leukocyten met behulp van discontinue Percoll gradiënten. Na isolatie van cellen, kleuring met verschillende antilichamen, zoals-maar niet beperkt tot-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T naar AEC) en de Universiteit van Texas in San Antonio.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
Tissue homogenisering en verlopen
- Percoll (Amersham)
- Balanced Salt 10X Hanks 'Solution, zonder Calcium en Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, zonder fenol rood (Gibco)
- 7-ml of 15 ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flowcytometrie
- Cel Staining Buffer (Biolegend)
- Gezuiverd Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Muis BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Anti-muis CD45 (kloon 30-F11), CD4 (kloon RM4-5), CD19 (kloon 6D5), BioLegend
- 10X fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, zonder Calcium en Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyd (Sigma Aldrich)
- Flowcytometrie-analyse uitgevoerd met een LSR II (BD Biosciences)
Referenties
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
