Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Samenvatting

Deze video protocol laat de neurosphere assay methode voor het genereren en uit te breiden neurale stamcellen uit een volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken.

Samenvatting

Isolatie en uitbreiding van de vermeende neurale stamcellen (NSCs) van de volwassen muizen hersenen werd voor het eerst beschreven door Reynolds en Weiss in 1992 in dienst een chemisch welbepaalde serum-vrije cultuur dat bekend staat als de neurosphere assay (NSA). In deze test, de meerderheid van de gedifferentieerde celtypen sterven binnen een paar dagen cultuur, maar een kleine populatie van de groeifactor responsieve voorloper cellen ondergaan actief proliferatie in de aanwezigheid van de epidermale groeifactor (EGF) en / basic fibroblastische groeifactor (bFGF). Deze cellen vormen kolonies van ongedifferentieerde cellen genaamd neurospheres, die op hun beurt kunnen worden subcultuur naar het zwembad van neurale stamcellen uit te breiden. Bovendien kunnen de cellen worden geïnduceerd om te differentiëren, het genereren van de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel zoals neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Deze test geeft een waardevol instrument om een consistente, duurzame bron van ongedifferentieerde CNS precursoren, die kunnen worden gebruikt voor in vitro studies en ook voor therapeutische doeleinden te leveren.

Deze video toont de NSA methode te genereren en uit te breiden NSCs van de volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken. De procedure omvat het oogsten van de hersenen van de volwassen muis, micro-dissectie van de periventriculaire regio, het prepareren van weefsels en cultuur in de NSA. De geoogste weefsel wordt eerst chemisch verteerd met behulp van trypsine-EDTA en vervolgens mechanisch gedissocieerd in NSC medium om een ​​enkele celsuspensie te bereiken en uiteindelijk uitgeplaat in de NSA. Na 7-10 dagen in de cultuur, de resulterende primaire neurospheres zijn klaar voor subcultuur om de hoeveelheid cellen die nodig is voor toekomstige experimenten te bereiken.

Protocol

Deel 1: Basis opgezet alvorens tot dissectie:

1. Juiste volume van complete NSC medium wordt bereid door het mengen van NeuroCult NSC basismedium en NeuroCult NSC proliferatieverdrag Supplementen op een 09:01 verhouding, respectievelijk. NSC medium kan ook worden gemaakt in het laboratorium op basis van NSC groeimedium samenstelling gepubliceerd in de literatuur ¹. Als uw lab heeft niet veel ervaring met het maken van medium, raden we aan commercieel beschikbare medium dat is de kwaliteit gecontroleerd op NSCs groei alvorens te worden verkocht (dat is het geval voor NeuroCult, Stem Cell Technolgies) te gebruiken.
2. Het medium wordt opgewarmd in een 37 ° C waterbad.
3. Cold HEPES-gebufferd minimum essentieel medium (HEM) met een hoge concentratie van antibiotica (10%) is voorbereid voor dissectie en wassen doel. Als alternatief kan NSC basaal medium met antibiotica suppletie ook gebruikt worden voor dit doel.
4. 30 tot 40 ml koud HEM met antibiotica wordt verdeeld in steriele 50 ml buizen voor de hersenen collectie.
5. Enkele 10cm plastic petrischalen nodig zijn om de hersenen te houden tijdens de dissectie en een 10cm steriele glazen petrischaal te ontleed weefsel vast te houden.
6. De chirurgische instrumenten die nodig zijn om de hersenen (grote schaar, kleine puntige schaar, pincet grote, kleine gebogen pincet, en een kleine spatel) of voor tissue dissectie (kleine tang, gebogen fijn pincet en scalpel) te verwijderen zijn gesteriliseerd met behulp van glazen kralen sterilisator bij 250 ° C of andere beschikbare methoden autoclaaf.
7. Dissection microscoop is afgenomen met 70% alcohol en het opzetten van binnen in de PC2 kap.

Deel 2: Oogsten volwassen muis hersenen en micro-dissectie:

1. 2-4 volwassenen (5-8 weken oud) muizen zijn verdoofd volgens een institutionele goedgekeurd dier protocol met behulp van 3-4% isofluraan of door intraperitoneale injectie van pentobarbital (120 mg / kg).
2. Cervicale dislocatie is uitgevoerd om te zorgen dat de dieren geen pijn en verdriet lijden.
3. De verdoofde muis wordt gelegd op haar buik op een absorberend vloeipapier, en het hoofd wordt gespoeld met 70% ethanol om het gebied te steriliseren.
4. Grote schaar worden gebruikt om het dier onthoofden net boven het cervicale ruggenmerg regio.
5. Kleine puntige schaar worden gebruikt om een ​​mediane caudale-rostraal cut te maken en om de schedel bloot te leggen.
6. De snijkanten van de huid worden gebruikt om het hoofd te houden en dan elk blad van een kleine schaar wordt geplaatst in elke orbitale holte naar een coronale snede tussen de banen te maken.
7. Met behulp van het foramen magnum als een entry point, is een longitudinale snede gemaakt door de schedel langs het pijlnaad en de twee zijdelingse sneden worden ook gemaakt op de kruising van de laterale wanden en de basis van de schedel. Voorzichtigheid dient te worden genomen niet aan de onderliggende schade aan de hersenen door het maken van kleine sneetjes en het waarborgen van de hoek van de bladen is zo ondiep mogelijk te maken.
8. De schedel liggende elk halfrond is vastgepakt en naar buiten geschild met behulp van een gebogen pincet aan de hersenen bloot te leggen, vervolgens met behulp van een kleine spatel bevochtigd, is het brein geschept in een 50 ml buis met HEM.
9. Deze procedure wordt herhaald totdat alle van de hersenen zijn geoogst.
10. De hersenen worden overgebracht naar de PC2 kap en drie keer gewassen met voldoende volume van koude steriele HEM om mogelijke verontreinigingen zoals bloed en haren te verwijderen. De hersenen worden dan overgebracht naar een 10cm petrischaal met HEM.
11. Om de voorhersenen periventriculaire regio ontleden, is het schaaltje met de hersenen onder de microscoop ontleden met een lage vergroting. De hersenen worden dan geplaatst plat op hun buik oppervlak en gehouden van de caudale zijde met fijne gebogen pincet. Een andere set van gebogen tang wordt gebruikt om de olfactorische bollen te verwijderen.
12. Na het verwijderen van de olfactorische bollen, zijn de hersenen gedraaid om het ventrale aspect bloot te leggen.
13. Een 90 ° coronale snede wordt gemaakt op het niveau van de optische chiasma en de caudale aspecten van de hersenen worden verwijderd.
14. Deze procedure wordt herhaald totdat alle hersenen zijn deelbaar.
15. Bij hogere vergroting, de rostrale aspecten van de hersenen zijn zo gedraaid dat het snijvlak naar boven wijst. Eerst wordt het septum verwijderd en weggegooid met een fijn gebogen micro-schaar of gebogen, puntig pincet, en dan de dunne laag van weefsel rondom de laterale wand van de ventrikels is gesneden, met uitzondering van de striatale parenchym en het corpus callosum. Ontleed weefsel is gebundeld in een 10 cm steriele glazen petrischaal.
16. Deze procedure wordt herhaald totdat alle hersenen zijn micro-ontleed.

Deel 3: Tissue voorbereiding en plating cellen:

1. De gepoolde weefsel is gehakt voor ongeveer 1-2 minuten met behulp van een scalpel, totdat er slechts heel kleine stukjes blijven.
2. Een totaal volume van 3 ml van 0,05% trypsine-EDTA wordt gebruikt en al het gehakt weefsel wordt omgezet in een 15 ml buis. 3 ml trypsine-EDTA is voldoende voor een goede spijsvertering van weefsels geoogst van maximaal 8 muizen.
3. De buis wordt gedurende 7 min in een 37 ° C waterbad.
4. Aan het einde van de enzymatische incubatie, is de buis terug naar de motorkap en een gelijk volume van soja trypsine-remmer wordt toegevoegd aan trypsine-activiteit te stoppen.
5. De schorsing is gepipetteerd op en neer om trypsine inactivatie te waarborgen en vervolgens gepelleteerd door centrifugeren bij 700 tpm (110 g) voor 5min.
6. Het supernatant wordt verwijderd en het weefsel stukken zijn geresuspendeerd in 150 pi steriel NSC basaal medium. Resetten van de pipet aan 200 ul, de klonten worden gescheiden door zachtjes en neer te pipetteren (3-7 keer) tot een gladde melkachtige enkele cel suspensie is ontstaan. Het aantal pippetting stappen is direct afhankelijk van de grootte van de deeltjes in het gehakt weefsel (het is beter om het weefsel zo gehakt in zeer kleine stukjes als het vergroten van de oppervlakte voor trypsine-activiteit). Langdurige en krachtige mechanische dissociatie kan leiden tot verminderde vorming van sfeer als gevolg van neurale stamcellen en voorlopercellen celdood.
7. Om puin en on-gesplitste stukken te verwijderen, is basaal NSC medium toegevoegd aan de gedissocieerde celsuspensie tot een totaal volume van 10-15ml te bereiken. De celsuspensie wordt door een 40μm cel zeef in een passende maat buis, en vervolgens gepelleteerd door centrifugeren bij 700 tpm (110 g) voor 5min.
8. Om verder het puin te verwijderen, is het raadzaam om de pellet opnieuw in suspensie in 10-15 ml van NSC medium en de celsuspensie centrifuge op 700 toeren per minuut (110 g) voor 5min.
9. Het supernatant wordt verwijderd. Vervolgens worden de cellen geresuspendeerd in de juiste hoeveelheid van complete NSC medium aangevuld met 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF en 1μl/ml van 0,2% heparine.
10. Los weefsel van een brein wordt in een T25 fles (met 5 ml van complete medium). De cellen worden vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C, 5% CO ₂ Voor 7-10 dagen tegen die tijd neurospheres zou moeten hebben gevormd. Weefsel geoogst van een brein meestal kan genereren 400-600 neurospheres.

Deel 4: passage en de uitbreiding van NSC:

1. Als de neurospheres klaar zijn voor subcultuur (150-200 micrometer in diameter), is het medium met onderbroken bollen verwijderd van de kolven, geplaatst in een geschikte grootte steriele cultuur buis, en gecentrifugeerd bij 700 tpm (110 g) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. Het supernatant wordt verwijderd en de sferen zijn geresuspendeerd in 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA. Als alternatief neurospheres kan ook worden gepasseerd met behulp van mechanische of chemische dissociatie methoden beschreven in de literatuur ^2,3.
3. De celsuspensie wordt geïncubeerd bij 37 ° C in een waterbad gedurende 2-3 minuten, dan een gelijk volume van soja trypsine-remmer wordt gebruikt om de trypsine-activiteit te stoppen.
4. De celsuspensie wordt zachtjes gepipetteerd op en neer om ervoor te zorgen dat de trypsine volledig is geïnactiveerd.
5. De celsuspensie wordt gecentrifugeerd bij 700 rpm gedurende 5 minuten. Vervolgens wordt het supernatant verwijderd en de cellen worden geresuspendeerd in 1 ml van NSC medium.
6. 10μl van de celsuspensie wordt gemengd met 90μl van trypan blauw om een ​​celgetal te voeren.
7. De cellen worden uitgeplaat bij een concentratie van 5x10 ⁴ Cellen / ml in volledige NSC medium aangevuld met 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF en 1μl/ml van 0,2% heparine in een geschikte grootte weefselkweek kolf. Gebruik 5 ml medium voor T25, 20 ml voor T75 en 40 ml voor T175 kolven.
8. Secundaire neurospheres worden gevormd in 5-7 dagen toen geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO ₂.

Deel 5: representatieve resultaten:

In het primair volwassen NSC cultuur, zal de meerderheid van de cellen sterven na 2-3 dagen, maar groeifactor reageren voorloper (met inbegrip van stamcellen en stamcellen) cellen woekeren (figuur 1) en het genereren van kolonies van ongedifferentieerde cellen na 6-8 dagen. In deze culturen een aanzienlijke hoeveelheid vuil is normaal gesproken aanwezig dat een ronde vorm zou kunnen verwerven, en kan worden verward met neurospheres. De hoeveelheid afval is direct afhankelijk van de micro-dissectie en weefsel bereidingstechnieken. Echte neurospheres zijn fase helder (lichtgevend) en meer sferische als grootte toeneemt (zie video). Na 7-10 dagen, moet de bollen worden afgerond, maar niet verdicht, en zou moeten meten tussen de 150 en 200 micrometer en moet ook rigide micro-spikes hebben aan de rand bij een sterke vergroting (figuur 2). Als de neurospheres kunnen groeien te groot, ze donker van kleur als gevolg van celdood in het midden van de bollen. De grote neurospheres zijn moeilijk te scheiden en uiteindelijk beginnen te hechten aan de ondergrond en te differentiëren.

Figuur 1. Primaire volwassen NSC cultuur 3 dagen na de plating. Pijlen geven kleine kolonies van proliferatieve NSC. Originele Vergroting; 20x.

Figuur 2. Passage een volwassene neurosphere 7 dagen na plating. Let op de micro-spikes aan de rand van de bol. Originele Vergroting; 20x.

Discussie

De neurosphere assay ² heeft opgedaan ruime aandacht in het onderzoek gemeenschap niet alleen voor de isolatie en de studie van NSCs van CNS ^4-5, maar ook voor de isolatie van andere soorten vermeende stamcellen uit een groot aantal weefsels, zoals ^borst-6 en ⁷ en het hart voor de identificatie van de hersenen, borst-en dikke darm tumor stamcellen ^8-9 suggereert dat deze cultuur systeem kan worden toegepast op een aantal van de somatische en tumor precursor celpopul...

Materialen

* Om HEM te maken, mix 110L pakje MEM and160ml van 1M HEPES en breng het volume tot 8,75 L met gedestilleerd water. Stel de uiteindelijke pH naar 7,4 en op te slaan bij 4 ° C.