$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
A: Chirurgische catheterisatie van de arteriële en veneuze circulatie
Deel 1: arteriële en veneuze katheter voorbereiding
- Snij 15 cm van de PE-50 (inwendige diameter van 0,58 mm (0.023 ") x een uitwendige diameter van 0.965 mm (0.038"). Snijd een deel van 1mm silastic buis (0,76 mm (0.030 ") interne diameter x 1.65mm (0.065 ") buitendiameter) voor gebruik als fixatie-kraal. Het straatverbod kraal voorkomt dat de rat van het uittrekken van de katheter zodra deze is op zijn plaats.
- Steek de uiteinden van de micro-pincet ontleden in het lumen van de remmende kraal en voorzichtig uit elkaar houden de uiteinden van de tang te rekken de opening breder. Met behulp van een ander paar micro ontleden tang, schuift u de silastic slang in het lumen van de remmende kraal. Veilig met sterke lijm lijm (Loctite Super Glue). De kraal plat liggen rond de katheter. Laat katheter te drogen (24 u).
- Voor een 300 gram rat, de slagader lijn is ~ 2.7cm van de remmende kraal, terwijl de vette lijn is ~ 3,2 cm. Catheter lengtes van het huisverbod worden aangepast door 0,5 cm voor elke 100 gram toename van het lichaamsgewicht. Niet afschuining de randen van de katheter omdat dit kan doorprikken van het schip tijdens het inbrengen.
- Onmiddellijk voorafgaand aan de operatie, de lijnen met gehepariniseerde zoutoplossing (10U/ml) te vullen, afdichting beide uiteinden met een roestvrij stalen buizen stekker en plaats in ethanol (70%) te steriliseren. Lucht drogen voorafgaand aan de insertie.
Deel 2: Chirurgische Voorbereiding
- Procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Calgary Dierverzorging en gebruik Comite en zich houden aan theCanadian Association for Laboratory Animal Science richtlijnen voor experimenten. De procedures hieronder beschreven werden uitgevoerd op volwassen, mannelijke Sprague-Dawley ratten (~ 300g). Alle procedures worden uitgevoerd onder isofluraan, hoewel het mogelijk is om te gebruiken injecteerbare anesthetica. Alle chirurgische ingrepen worden uitgevoerd zorgen voor aseptische technieken. Chirurgische apparatuur, bekers en gehepariniseerde zoutoplossing zijn autoclaaf gesteriliseerd. Chirurgische handschoenen, spuiten en katoenen getipt applicators worden gekocht gesteriliseerd van de leverancier.
- Weeg de rat en noteer het resultaat. Het gewicht zal belangrijk zijn in de post-operatieve controle van de dieren. Alleen dieren die gewicht terug te krijgen voor pre-operatie niveaus moeten worden gebruikt voor experimenten. Verdoven rat (3% isofluraan) in een verdovingsmiddel doos. Houd de rat bij ~ 2% isofluraan tijdens een operatie met behulp van een neuskegel. Een operatie moeten worden uitgevoerd in een gedesinfecteerde gebied dat asepsis bevordert.
- Bereid het dier door het verwijderen van haar van de operatiewond (nek en schouderbladen). Een kleine tondeuse of chemische ontharingsmiddel gebruikt kunnen worden. Voer deze procedure uit in een gebied apart van waar de ingreep zal worden uitgevoerd.
- Veilig dier tot chirurgische tafel. Zorg ervoor dat dier is volledig verdoofd door te controleren op de aanwezigheid van voet / oog reflexen. Bereid de chirurgische sites met een geschikt ontsmettingsmiddel huid (70% ethanol, gevolgd door betadine scrub, gevolgd door 70% ethanol).
Deel 3: Chirurgie
- Maak kleine verticale middellijn incisie van 1 cm superieur is aan het borstbeen (Pick up huid lengterichting langs de mediale as met een pincet en snijd met een schaar of scalpel).
- Blunt ontleden met behulp van micro ontleden tang aan de linkerkant musculus sternocleidomastoideus spier bloot te leggen. Weerspiegelen deze spier tot ongeveer 1 cm van de linker halsslagader bloot te leggen. Gebruik micro ontleden tang onder halsslagader aan de slagader zijn plaats te houden. Voorzichtig te plagen uit bindweefsel van de halsslagader. Het is belangrijk om de nervus vagus van de slagader te isoleren zonder beschadiging van zowel de arterie of de zenuw. Isoleer dan de slagader ligeren het craniale uiteinde met 4-0 zijde hechtdraad (dit zal worden gebruikt om de halsslagader tijdens een operatie te manipuleren). Let op: 4-0 hechtingen moeten worden gesteriliseerd met 70% ethanol voor gebruik.
- Klem het vat met gekartelde, micro ontleden tang. Prik de geligeerde eindigen met een 21 gauge VENOJECT Multi-Sample Luer-adapter. Verwijder de roestvrij stalen buis plug en zorgvuldig katheter in te brengen met behulp van een steriele katheter introducer om toe te geven in de slagader. Het waarborgen van de catheter is beveiligd met een pincet, gedeeltelijk los micro ontleden tang vastzetten van de slagader en ga het inbrengen van de katheter naar de kraal. Op dit punt moet de tip van de katheter in de aortaboog. Zorg ervoor dat u katheter release, zal de druk van het vat kracht het uit.
- Bind twee 4-0 hechtingen veilig hieronder kraal en een boven en bevestigen dat de katheter monster. Spoel de lijn met 10U/ml gehepariniseerde zoutoplossing. Re-plug van de externe uiteinde van de katheter met een roestvrij stalen buizen stekker.
- Met dezelfde incisie, stompe ontleden naar rechts externe halsader bloot te leggen. Isoleer zorgvuldig en ligeren het craniale uiteinde met zijden hechtdraad. Prik de ader aan met een 21 gauge VENOJECT Multi-Sample Luer-adapter. Verwijder de roestvrij stalen buis plug en plaats katheter met steriel catheter introducer naar de kraal en bind twee hechtingen onder de kraal. Tie derde hechtdraad boven kraal en bevestigen dat het monsters. Gelijk met de veneuze lijn 10U/mL gehepariniseerde zoutoplossing. Re-plug van de externe catheter einde met roestvrij stalen buizen stekker.
- Tunnel 14-gauge stompe naald onder de huid en maken incisie in de rug tussen de schouderbladen. Rijg de katheters via de naald om hen exterioriseren aan de achterkant van de rat. Ongeveer 4 cm van de lijn zichtbaar is. Gesneden 0,5 cm van Tygon S-50-HL Medical Tubing, plaats het rond zowel de exteriorized katheters en veilig met een tape zoals vereist (blauw voor de ader, rood voor slagader). Hertest katheters te doorgankelijkheid zorgen, spoelen en vullen met 150U/ml gehepariniseerde zoutoplossing om te voorkomen dat stolling.
- Sluit alle insnijdingen met 3-0 zijden hechtdraad. Plaats rat vatbaar, in voorverwarmde, schone kooi met voedsel in de bodem van de kooi.
B: Postoperatieve zorg
Deel 1: Onmiddellijke Postoperatieve zorg en bewaking
- Zodra de rat herwint volledige ambulante vermogen en alertheid de terugkeer van de rat te stallen.
- Laat de rat om te herstellen voor 3-5 dagen.
- Monitor dagelijks voor infecties, pijn en veranderingen in het gewicht. Infectie kan van belang indien er bij lozing van incisie sites, algemene lethargie en / of pijn wordt waargenomen. Pijn wordt aangegeven door gebogen houding, ruches terug vacht en de afwezigheid van de ambulante en / of eetgedrag. Een verlies in gewicht kan onmiddellijk worden ervaren na de operatie tot drie dagen na de operatie, maar moet het gewicht stabiliseren en / of verhogen tot binnen 10% van de pre-operatieve gewicht binnen 5 dagen. Ernstig gewichtsverlies kan wijzen op infectie, een beroerte en / of pijn.
- Hertest katheters dagelijks om doorgankelijkheid te verzekeren.
Deel 2: Onderhoud katheter doorgankelijkheid
- Elke dag tijdens post-op herstel, vul 1ml Slip Tip Spuiten met 150U/ml gehepariniseerde zoutoplossing en dop met een 22 gauge stompe naald. De stompe naald wordt ingevoegd in 20cm van de PE-50 buis met 23 gauge roestvrij stalen buis koppeling aan de andere kant.
- Verwijder luchtbellen door het plaatsen van het uiteinde met de slang koppeling hoger is dan de rest van de 1 ml spuit en het indrukken van de bubbels uit de lijn.
- Klem uit de arteriële lijn geëxternaliseerde van de rat met hemostats net onder de stekker.
- Verwijder de katheter stalen plug met behulp van het tweede paar hemostats.
- Steek de slang koppeling verbonden met de spuit in de arteriële lijn en laat de hemostats occlusie van de geëxternaliseerde arteriële katheter.
- Zuig het arteriële bloed van de katheter in de spuit. Indien de catheter niet gemakkelijk te trekken kan het nodig zijn om zeer voorzichtig in een kleine hoeveelheid van spoeloplossing duwen door de katheter tot aan de punt van de katheter in verjagen geval is ingeklemd tegen de vaatwand. De katheter is volledig gewist wanneer het bloed bereikt de spuit.
- Klem de PE-50 buizen dicht bij de 1ml spuit en gooi de spuit. Vervangen door een nieuwe spuit gevuld met verse 150U/ml gehepariniseerde zoutoplossing. Ontspan de slang en het houden van de nieuwe spuit rechtop, flick de nieuwe spuit met een vinger om eventuele nieuwe luchtbellen te verdrijven naar boven en weg van de lijn. Let op: Er moet voor worden gezorgd als luchtbellen kunnen een beroerte veroorzaken.
- Injecteer de 150U/ml heparinzed zoutoplossing totdat de catheter lijn is helder en vrij van bloed.
- Klem uit de arteriële lijn geëxternaliseerde van de rat met hemostats net onder de slang koppeling. Verwijder de spuit connector van de arteriële catheter lijn en vervang het door de roestvrij stalen buizen stekker.
- Laat de hemostats occlusie van de geëxternaliseerde arteriële katheter.
- Herhaal dit voor veneuze lijn. Echter, vanwege de lage veneuze druk bemonstering is vaak niet mogelijk. Als de 150U/ml heparinzed zoutoplossing kan worden toegediend met minimale weerstand is het waarschijnlijk dat de katheter goed gepositioneerd is in de ader.
C: hyperinsulinemische-Euglycemic Clamp
Deel 1: Clamp Set-up en voorbereiding
- Weeg de rat en registreer het gewicht. Dit vereist zal zijn om insuline en glucose infusiesnelheden te bepalen. Snel de rat gedurende minstens 5u voor om te experimenteren. Dit zorgt ervoor dat het dier in een postprandiale toestand en de bijdrage van glucose uit de voeding wordt geminimaliseerd. Zet de rat in een kleine container / kooi met beddengoed dat buitensporige bewegingen beperkt. Het dier moet in staat zijn om te draaien en bruidegom vrij.
- Stel lijnen en infuuspompen zoals te zien is in figuur 1. P50 aansluitslang lengtes zijn als volgt: spuit naar Y-connector is 8cm, Y-connector om rat 15cm is, arteriële lijn is 20cm, en veneuze lijn is 10 cm in lengte. Verwijder de roestvrij stalen buis pluggen en spoel jugularis en arteriële lijnen naar infusie zorgen en bemonstering respectievelijk met 10U/ml gehepariniseerde zoutoplossing.
- Bepaal insuline volume nodig. Dit zal variëren afhankelijk van het insuline-niveau en het gewicht van de rat. Hier wordt 4mU/kg/min toegediend met een snelheid van 2uL/min. Dit is een hoge fysiologische dosis. Waar mogelijk moet worden getracht om infuus volumes te beperken. Insuline moet adequaat worden verdund en worden toegediend in aanwezigheid van plasma. Een 3% rat plasma-oplossing in een zoutoplossing wordt gebruikt om de insuline te verdunnen in dit laboratorium. Insuline is HumulinR 100U/ml (Eli Lily), hoewel ook andere snelwerkende insuline kan worden gebruikt. Zorg ervoor dat verdunde insuline is goed gemengd voorafgaand aan de invoering van infuus spuit.
- Bereid 50% dextrose. Dit kan direct geplaatst worden in de spuit op de infusiepomp. Markeer pomp met 'glucose' in de toekomst verwarring te voorkomen. Vergeet niet om voldoende hoeveelheden insuline en glucose voor het onderzoek te waarborgen. Klemmen duren over het algemeen ~ 2u. In het huidige protocol, worden 3ml spuiten gebruikt worden.
- Plaats glucose en insuline spuiten op Harvard Apparatuur Model 11 Plus Spuit Pompen. Advance glucose naar Y-connector en klem lijn met een hemostat. Advance insuline aan dier-, klem lijn met hemostat. Klem lijnen en laat rat voorafgaande ontspannen voor 30min tot het starten van het experiment. LET OP: hemostaat tip bewakers worden voorgesteld om te voorkomen dat permanente krimpen van de lijnen.
- Bereid centrifuge en EDTA-gecoate buizen voor plasma-collectie. In de huidige studie, zullen extra bloedmonsters worden verkregen nadat het dier is geklemd.
Deel 2: Experimentele Protocol
- Een baseline insuline monster en hematocriet monster moet worden verkregen. Hematocriet sampling zorgt ervoor dat het bloedvolume gehandhaafd blijft gedurende het experiment. Het algemeen moet hematocrietwaarden niet vallen meer dan 10% van de oorspronkelijke waarde.
- Verkrijgen van een baseline glucose monster (One Touch Ultra, LifeScan, Inc) en bepalen de hele bloedsuikerspiegel te worden geklemd. Hier hebben we klem op euglycemia, of 5.0-5.5mm (figuur 2). Na elke bloedmonster, spoel arteriële lijn met een klein volume van 10U/ml gehepariniseerde zoutoplossing om te voorkomen dat stolling. LET OP: Zorg ervoor dat er geen klonters of luchtbellen zijn in de regel voorafgaand aan de infusie. Deze kunnen het dier geven een beroerte.
- Start insuline-infusie. Neem de bloedglucose op 5-10min interval, monitoring glucose op elk tijdstip. Pas de glucose-infuus tarief als nodig is tot een steady state is bereikt. Dit proces is over het algemeen een trial and error proces en kan 30 minuten tot> 2u. De niveaus van glucose nodig is om glycemie te behouden zijn afhankelijk van de experimentele protocol, diersoort en de omstandigheden aanwezig zijn (figuur 2).
- Steady-state glucosespiegels zijn drie opeenvolgende metingen binnen een bepaald bereik. Hier wordt drie lezingen in ~ 1 mM beschouwd als geklemde (bijv. 4,8, 5,2, 5,6 mm). Zodra steady state is bereikt, nemen de glucose infusiesnelheid nodig is om glycemie te behouden voor een periode van 30min. Gedurende deze tijd extra bloedmonsters kan worden verkregen. Minimaal, moet een tweede plasma insuline monster en hematocriet monster worden verkregen.
- Zodra klem is voltooid, dieren kunnen worden gebruikt voor verdere testen of geëuthanaseerd en weefsels verzameld voor verdere analyse. Afhankelijk van het dier, kan katheter lijnen blijven octrooi voor 5-7 dagen.
D: hyperinsulinemische-Euglycemic (Insuline) Clamp resultaten
Wanneer correct uitgevoerd, de klem procedure beoordeelt de steady-state insuline gevoeligheid van de rat. Bij de presentatie van gegevens uit de klem, is het essentieel om document glucose niveaus en glucose-infuus tarieven. Stabiele glucose niveaus gedurende een tijdsverloop van minimaal 30min (Figuur 3) zijn indicatief voor een steady state. Glucose wordt als stabiel beschouwd alleen als volbloed glucose wordt behouden binnen ~ 1mm. Glucose-infuus-tarief is gebleken de niveaus van exogene glucose nodig is om glycemie te behouden. Waar mogelijk, moeten deze cijfers worden weergegeven als een tijdsverloop in plaats van enkele, gemiddelde waarde (figuur 4).
Andere aanbevolen maatregelen moeten worden gemeld, plasma-insuline en hematocriet. De bepaling van zowel op nuchtere maag en insuline niveaus geklemd bevestigen dat de insuline is met succes toegediend en zal detecteren eventuele verschillen in niveau tussen de behandelingsgroepen (figuur 5). Het verkrijgen van hematocriet maatregelen bij aanvang en aan het einde van de insuline klem worden voorgesteld (Figuur 6). Dit is om ervoor te zorgen hematocrietwaarden niet meer dan 5% vallen tijdens het experiment en de bijbehorende veranderingen in bloedvolume en flow hebben geen invloed op glucose.
Figuur 1. Experimentele set-up. Figuur 1 toont ongeremd, bewuste rat in de klem procedure. Katheters laten bloedafname en infusies zonder behandeling van het dier. Pompen aan de linker bevatten insuline en glucose.
t ">
Figuur 2. Verwachte gegevens tijdens de klem procedure. Voor het verkrijgen van een klem bij aanvang niveaus (euglycemia, 5mm), worden de niveaus van exogene glucose (D50) gemanipuleerd tot aan de basislijn of 'klem' is bereikt.
Figuur 3. Verwachte plasma glucose resultaten van de klem procedure. Als het dier is 'geklemd', bloedglucose relatief stabiel over de tijd en de experimentele groep.
Figuur 4. Vertegenwoordiger van glucose-infuus tarieven van de klem procedure. De hoeveelheid van exogene glucose nodig is om te behouden euglycemia verschilt. Dit wordt geïllustreerd met een controle (chow gevoed) en vetrijke gevoed (insuline-resistent) dieren. Het hoge vet gevoed dier vereist minder glucose-infusie om glycemie te behouden, vooral omdat het ongevoelig is voor insuline toegediend het.
Figuur 5. Vertegenwoordiger plasma insuline van de rat. De plasma insuline tijdens de insuline klem hoger moet zijn dan de nuchtere, uitgangsniveau voor de plasma insuline. Dit zorgt voor insuline correct is toegediend aan het dier tijdens de insuline klem.
Figuur 6. Reporting hematocriet. De baseline hematocriet en hematocriet na het experiment moet worden verkregen en gerapporteerd. Dit zorgt voor hematocrietwaarden vallen niet meer dan 5% van de uitgangswaarde als gevolg van excessieve arteriële bloedafname.