Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een high throughput scherm voor cellulolytische activiteit van een metagenomic bibliotheek uitgedrukt in Escherichia coli. Het scherm is oplossing gebaseerd en sterk geautomatiseerde, en maakt gebruik van een-pot chemie in 384 goed microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing als een absorptie meting.

Samenvatting

Cellulose is de meest voorkomende bron van organische koolstof op de planeet, heeft een brede industriële toepassingen met steeds meer nadruk op de productie van biobrandstoffen ^een. Chemische methoden aan te passen of af te breken cellulose vergen doorgaans sterke zuren en hoge temperaturen. Als zodanig zijn enzymatische methoden geworden prominent in het bioconversie proces. Terwijl de identificatie van de actieve cellulasen van bacteriën en schimmels geïsoleerd is enigszins effectief, de overgrote meerderheid van de microben in de natuur te weerstaan ​​laboratorium teelt. Milieu-genoom, ook wel bekend als metagenomic, screening benaderingen zijn een grote belofte in het overbruggen van de kloof teelt in de zoektocht naar nieuwe bioconversie enzymen. Metagenomic screening benaderingen met succes hersteld roman cellulasen uit een omgeving net zo gevarieerd als de bodem ^2, buffels pens ³ en de termiet achterste gut ⁴ met behulp van carboxymethylcellulose (CMC) agarplaten gekleurd met congo rode kleurstof (gebaseerd op de methode van Teather en Wood ^5). Echter, de CMC methode is beperkt in de doorvoer, is niet kwantitatief en manifesteert zich een lage signaal-ruisverhouding ^6. Andere methoden zijn gemeld ^{van 7,8,} maar elk gebruik een agarplaat-gebaseerde test, hetgeen ongewenst is voor high-throughput screening van grote insert genomische bibliotheken. Hier presenteren wij een oplossing op basis van het scherm voor het cellulase-activiteit met behulp van een chromogene dinitrofenol (DNP)-cellobioside substraat ^9. Onze bibliotheek werd gekloneerd in de pCC1 Copy Control fosmid voor het testen van de gevoeligheid te verhogen door middel van copy number inductie ^10. De methode maakt gebruik van een-pot chemie in 384-wells microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing die als een absorptie meting. Deze uitlezing is kwantitatief, gevoelig en geautomatiseerd met een doorvoersnelheid van maximaal 100X 384-well platen per dag met behulp van een vloeistof handler en plaat lezer met aangehechte stapelsysteem.

Protocol

Vóór het begin van dit protocol, moet u uw metagenomic bibliotheek die is opgeslagen in een 384 wells plaat-formaat. In ons onderzoek gebruikten we de pCC1 kopie controle fosmid vector in combinatie met faag T1-resistente TransforMax EPI300-T1 ^R E. coli-cellen als de bibliotheek gastheer en opgeslagen onze borden bij -80 ° C ^11.

1. Replicatie van de Metagenomic Bibliotheek Platen

1. Ontdooi de platen met uw bibliotheek bij 37 ° C gedurende ongeveer 20 minuten, of totdat alle putten zijn ontdooid.
2. Gebruik het UV-licht steriliseren-functie op de qPix2 om de robot te steriliseren gedurende 15 minuten.
3. Bereid LB bouillon met chlooramfenicol bij een uiteindelijke concentratie van 12.5ug/mL en arabinose op 100ug/mL in een 500ml fles reagens. Elke plaat zal gebruik maken van ongeveer 20 ml, plus een aanvullend 50ml toe te staan ​​voor de dood volume.
4. Stel de qFill3 als instructies per fabrikant met de media fles bevestigd aan het spruitstuk via de steriele slang. Programma is voor de juiste hoeveelheid media, en stel deze in een 45uL volume in elk putje te vullen.
5. Spoel de lucht uit de slang en veelvuldige gebruik van de zuivering functie van de robot tot de media zichtbaar is vanuit elke pin van het spruitstuk.
6. Vul het gewenste aantal platen met LB media met behulp van de qFill3. Elke plaat duurt ongeveer 20 seconden in te vullen.
7. Laad de bibliotheek platen en de verse platen in de juiste gebieden van de qPix2 robot. Vul het reinigen van baden met de juiste reagentia; 2% Micro90 in het achterste bad, geautoclaveerd gedestilleerd water in het midden bad, 80% ethanol in de voorste bad.
8. Gebruik de "Kopiëren" programma van de qPix2. In de software, selecteert u de juiste kop, het aantal en de aard van de bron en de bestemming platen platen. Ook het opzetten van de kop tussen replicaties, meestal 6 cycli schoon in elk bad is genoeg. Capaciteit van de machine is 10 platen per keer, en het duurt ongeveer 15 minuten om ze allemaal te repliceren met een 384 pin hoofd (of ongeveer 50 minuten met een 96 pin hoofd).
   Opmerking: Er is een optie om "Stir Source" of "Roer Destination". Het is aanbevolen om geen gebruik van de opties, problemen hebben eerder opgetreden met onze robot het gebruik ervan.
9. Zodra de platen worden gerepliceerd, groeien de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur in een vochtige doos. Omdat we het induceren van een groot aantal kopieën van fosmid met toevoeging van arabinose, de klonen hebben de neiging om te groeien langzamer dan niet-geïnduceerde klonen. Terug te keren in de bibliotheek platen tot -80 ° C.
   Let op: Incubatie in een doos luchtvochtigheid zorgt voor verdamping van de media niet voorkomt in de putjes op de rand van de platen, het bijhouden van een uniforme omgeving voor alle putten.
10. Reinig de qFill3 robot door eerst spoelen met water (~ 50 ml) en daarna 80% ethanol (~ 50 ml). Demonteer de onderdelen, en schoon en autoclaaf de fles, deksel, en slangen gewikkeld in aluminiumfolie.

2. Het meten van de groei van E. coli Clones

1. Verwijder de platen van 37 ° C incubator. Verwijder en vernietiging van het deksels, borden en leg op het magazine laadvloer voorzien van de RapidStak, tot een maximum van 25 platen.
   Opmerking: De plaat aan de onderkant van de stapel zal de eerste zijn die te lezen zijn. Zorg ervoor dat bij te houden van de orde van de platen, omdat de software niet te nemen dit.
2. Verwijder een magazine van de Rapid Stak, zorg dan dat leeg is, en druk het op de stapel borden te lezen. Pak hem bij het handvat, en de platen moeten allemaal worden geladen in het magazijn. Laad het magazijn in de RapidStak.
   Opmerking: Het tijdschrift heeft een kleine schroef in de hoek aangeeft welke hoek de A1 putten van de platen moeten gaan. Het magazine zal alleen monteren in de RapidStak in een richting.
3. Open het SkanIt RE programma op de computer is aangesloten op de machines. Selecteer "New Session" een toepasselijke naam. Kies "Corning Flat Bottom 384-wells plaat", zoals de plaat type.
4. In het "Plate Layout", selecteert u de "Wizard" knop, en kies het naar 384 onbekenden toe te voegen aan uw bord.
5. In het "Protocol", selecteert u de "Nou Loop" optie, en voer voor 384 bronnen. Een "Nou Loop" icoon zal verschijnen in de flow-boom aan de linkerkant van het scherm. Selecteert u het pictogram en klik toe te voegen "Fotometrische meten". Stel het te lezen op 600 Nm.
6. Sla uw protocol met een unieke naam, en sluit het SkanIt RE-programma.
7. Op de computer, opent u de PolaraRS programma.
8. Op de hoofdpagina zal er tabel met de instrumenten aangesloten op het RapidStak apparaat. De VarioSkan moet zich aan de linkerkant van deze tabel. Onder de VarioSkan kop, zullen er twee links: "RunSession" en "Incubate". Klik op de "RunSession" optie.
9. Wordt een nieuw venster, de test venster, zal verschijnen met een stroomdiagram in het midden. Selecteer de "RunSession" item (het zou het enige punt aanwezig te zijn). Aan de rechterkant van het scherm een ​​drop-down menuzal verschijnen. Zoek de naam van uw opgeslagen SkanIt RE lopen in dit menu.
   Let op: Er lijkt geen enkele rationele bestellen om dit menu. Het is niet alfabetisch, of op datum toegevoegd, of verband houden met waar op de computer het protocol wordt opgeslagen. Dit betekent dat je moet kijken door alle protocollen voor het vinden van uw eigen, wat een pijn.
10. Als je eenmaal hebt gekozen uw protocol, in de rechterbovenhoek klikt u op "Uitvoeren deze test".
11. Een box zal verschijnen, waarin u wordt gevraagd aan te geven welk tijdschrift te gebruiken als de bron, en die het tijdschrift is leeg. Het onderste vak op het scherm komt overeen met de voorkant magazine. [Optioneel: Het vraagt ​​u om het aantal platen geladen naar een schatting voor de hoeveelheid tijd die nodig is vast te stellen. Deze schatting is normaal gesproken weg.]
12. Zorg ervoor dat zowel de RapidStak en de VarioSkan zijn ingeschakeld, en druk op "OK".
13. De RapidStak zal automatisch laad je platen in de plaat lezer, maakt de continue metingen van platen. Voor het lezen van 25 platen duurt ongeveer 50 minuten.
    Opmerking: Het is aanbevolen om de eerste plaat in acht laden in de VarioSkan om een ​​goede uitlijning van de machines te verzekeren. Als de RapidStak niet wordt geladen de plaat lezer goed gebruik maken van de "Pauze deze test" knop in de rechterbovenhoek van het PolaraRS venster.
14. Zodra de VarioSkan is gedaan het lezen van alle borden, verwijder de volledige blad en plaats het op het tijdschrift laadvloer. Til de buitenste rechthoek van het platform, en het tijdschrift zou moeten glijden, waardoor de platen staan ​​in een stapel in het midden. Plaats de deksels op de juiste platen.

3. Toevoeging van de Assay Mix op elk bord

1. Bereid test mix met behulp van kant en klare 10x voorraad van lysis mix (10% Triton X-100, 100mm ris, 10 mM EDTA) in 50 mM kaliumacetaat buffer bij pH 5,5. Bereid een voorraad van maximaal 75mg/mL DNP-cellobioside substraat in DMSO, zorg ervoor dat de ondergrond volledig is opgelost. Voeg DNP-cellobioside stockoplossing aan assay mengen tot een uiteindelijke concentratie van 0.1mg/mL. Elke plaat zal gebruik maken van ongeveer 20 ml van de oplossing, plus een aanvullend 50ml toe te staan ​​voor de dood volume.
   Let op: DNP-Cellobioside is niet gemakkelijk oplosbaar in water, dus oplossen in DMSO verhoogt de oplosbaarheid. De aanwezigheid van DMSO in de uiteindelijke analyse-oplossing heeft geen waarneembare effecten.
2. Stel de qFill3 als instructies per fabrikant met de media fles bevestigd aan het spruitstuk via de steriele slang. Programma is voor de juiste hoeveelheid media, en stel deze in een 45uL volume in elk putje te vullen.
3. Spoel de lucht uit de slang en veelvuldige gebruik van de zuivering functie van de robot tot de media zichtbaar is vanuit elke pin van het spruitstuk.
4. Voeg assay mix om elke plaat met behulp van de qFill3. Elke plaat duurt ongeveer 20 seconden in te vullen.
5. Zodra test mix is ​​toegevoegd, Incubeer de platen bij 37 ° C in een luchtvochtigheid box voor 12-16 uur.
   Let op: Over-incubatie van platen als de test mix wordt toegevoegd zal verdamping veroorzaken in de buitenste putjes van de plaat, waardoor een hogere absorptie metingen dan gezien wordt voor de binnenkant putten. Dit kan worden gecompenseerd door incuberen platen in een vochtige kamer.

4. Het lezen van absorptie van getest Clones

1. Verwijder de platen van 37 ° C incubator. Verwijder en vernietiging van het deksels, borden en leg op het magazine laadvloer voorzien van de RapidStak, tot een maximum van 25 platen.
   Opmerking: De plaat aan de onderkant van de stapel zal de eerste zijn die te lezen zijn. Zorg ervoor dat bij te houden van de orde van de platen, omdat de software niet te nemen dit.
2. Verwijder een magazine van de Rapid Stak, zorg dan dat leeg is, en druk het op de stapel borden te lezen. Pak hem bij het handvat, en de platen moeten allemaal worden geladen in het magazijn. Laad het magazijn in de RapidStak.
   Opmerking: Het tijdschrift heeft een kleine schroef in de hoek aangeeft welke hoek de A1 putten van de platen moeten gaan. Het magazine zal alleen monteren in de RapidStak in een richting.
3. Open het SkanIt RE programma op de computer is aangesloten op de machines. Selecteer "New Session" een toepasselijke naam. Kies "Corning Flat Bottom 384-wells plaat", zoals de plaat type.
4. In het "Plate Layout", selecteert u de "Wizard" knop, en kies het naar 384 onbekenden toe te voegen aan uw bord.
5. In het "Protocol", selecteert u de "Nou Loop" optie, en voer voor 384 bronnen. Een "Nou Loop" icoon zal verschijnen in de flow-boom aan de linkerkant van het scherm. Selecteert u het pictogram en klik toe te voegen "Fotometrische meten". Stel het te lezen op 400nm.
6. Sla uw protocol met een unieke naam, en sluit het SkanIt RE-programma.
7. Op de computer, opent u de PolaraRS programma.
8. Op de hoofdpagina zal er tabel met de instrumenten aangesloten op het RapidStak apparaat. De VarioSkan moet zich aan de linkerkant van deze tabel. Onder de VarioSkan kop, zullen er twee links: "RunSession" en "Incubate ". Klik op de" RunSession "optie.
9. Wordt een nieuw venster, de test venster, zal verschijnen met een stroomdiagram in het midden. Selecteer de "RunSession" item (het zou het enige punt aanwezig te zijn). Aan de rechterkant van het scherm een ​​drop-down menu zal verschijnen. Zoek de naam van uw opgeslagen SkanIt RE lopen in dit menu.
10. Als je eenmaal hebt gekozen uw protocol, in de rechterbovenhoek klikt u op "Uitvoeren deze test".
11. Een box zal verschijnen, waarin u wordt gevraagd aan te geven welk tijdschrift te gebruiken als de bron, en die het tijdschrift is leeg. Het onderste vak op het scherm komt overeen met de voorkant magazine. [Optioneel: Het vraagt ​​u om het aantal platen geladen naar een schatting voor de hoeveelheid tijd die nodig is vast te stellen. Deze schatting is normaal gesproken weg.]
12. Zorg ervoor dat zowel de RapidStak en de VarioSkan zijn ingeschakeld, en druk op "OK"
13. De RapidStak zal automatisch laad je platen in de plaat lezer, maakt de continue metingen van platen.
    Opmerking: Het is aanbevolen om de eerste plaat in acht laden in de VarioSkan om een ​​goede uitlijning van de machines te verzekeren. Als de RapidStak niet wordt geladen de plaat lezer goed gebruik maken van de "Pauze deze test" knop in de rechterbovenhoek van het PolaraRS venster.
14. Zodra de VarioSkan is gedaan het lezen van alle borden, verwijder de volledige blad en plaats het op het tijdschrift laadvloer. Til de buitenste rechthoek van het platform, en het tijdschrift zou moeten glijden, waardoor de platen staan ​​in een stapel in het midden. De platen kunnen worden afgevoerd volgens uw lab procedures.
15. Om de absorptie lezingen, open SkanIt RE software, exporteren en kies "Open een bestaand bestand".
16. Selecteer de map waarin u uw sessie, druk op de "+"-pictogram om de lijst uit te breiden en onder de titel rubriek worden opties label "Container 1" tot "Container N", afhankelijk van het aantal platen. Selecteer het eerste plaatje te analyseren.
17. In de menubalk aan de bovenkant van de pagina, kiest u "Data Processing> Rapport / Export"
18. Kies de gewenste opties voor de export.
    Opmerking: Ik kies meestal "Plate Lay-out" en "Photometric" data voor de export.
19. Klik op "View Report" en dan "Bestand> Opslaan". Kies de gewenste map. De output formaat is een Microsoft Excel spreadsheet

5. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van absorptie metingen van een enkele 384 wells plaat met daarin een positieve kloon is weergegeven in figuur 2. Positieve klonen vertonen een duidelijke toename van absorptie meer dan degenen die niet uiten cellulase activiteit. Verschillen in assay tijd, goed gelegen op de plaat, of DNP-concentratie (kunnen worden ingevoerd door te filteren op niet-opgeloste DNP) kan van invloed zijn absolute absorptie metingen. Met een relatieve absorptie metingen, zoals het verschil in absorptie boven het gemiddelde plaat of kolom gemiddelde, zijn een meer robuuste methode van het identificeren van cellulase positieve klonen.

Na de identificatie van de positieve klonen uit de bibliotheek platen, is het raadzaam om alle positieve klonen repliceren naar een nieuwe plaat voor secundaire screening. Dit elimineert effecten van zowel locatie of plaat variatie en zorgt voor meer directe vergelijking tussen de positieve klonen.

Figuur 1. Stroomdiagram van de high-throughput assay voor een metagenomic bibliotheek gekloond in E. coli en opgeslagen bij -80 ° C.

Figuur 2. Absorbance meetwaarden van een 384-wells plaat met daarin een positieve kloon. Cellulase positieve klonen kunnen worden geïdentificeerd door de sterk toegenomen absorptie over negatieve klonen.

Discussie

Een high throughput scherm voor de snelle detectie van cellulolytische activiteit van een grote insert genome DNA metagenomic bibliotheek expressie gebracht in E. coli is beschreven in dit protocol. Deze methode is een verbetering ten opzichte van de CMC / Congo Red assay vaak gebruikt in de literatuur. Het is oplossing gebaseerd, en maakt het mogelijk voor een-pot chemie screening in 384-well platen, met de uiteindelijke uitvoer als absorptie metingen van een plaat lezer waardoor kwantitatieve analyse. De auto...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
qPix2	Genetix		Met 384-pin gridding head
qFill3	Genetix		Met 384-well manifold
Varioskan	Thermo Fisher Scientific, Inc.
RapidStak	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Aangesloten op Varioskan
Micro90 Detergent	Cole-Parmer	18100-00	Verdund tot 2% in water
Ethanol	Major Lab Supplier		Verdund tot 80% in water
Chloramfenicol	Sigma-Aldrich	C0378	12.5mg/mL in ethanol
LB bouillon, Miller	Fisher Scientific	BP1426-2	25g/L, geautoclaveerd
384-well vlakke bodemplatjes	Corning	3680
L-(+)-Arabinomse	Sigma-Aldrich	A3256	100mg/mL in water
Kaliumacetaat	Fisher Scientific	P171	50mM in water, geautoclaveerd, aangepast naar pH 5,5 met HCl
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253	In TE buffer oplossing, 100mM
EDTA dinatriumzout	Sigma-Aldrich	E5134	In TE buffer oplossing, 10mM
2,4-dinitrofenyl cellobiosid			Verstrekt door Dr. Steve Withers, UBC
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418