Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Summary

Dit protocol beschrijft een high throughput scherm voor cellulolytische activiteit van een metagenomic bibliotheek uitgedrukt in Escherichia coli. Het scherm is oplossing gebaseerd en sterk geautomatiseerde, en maakt gebruik van een-pot chemie in 384 goed microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing als een absorptie meting.

Abstract

Cellulose is de meest voorkomende bron van organische koolstof op de planeet, heeft een brede industriële toepassingen met steeds meer nadruk op de productie van biobrandstoffen ^een. Chemische methoden aan te passen of af te breken cellulose vergen doorgaans sterke zuren en hoge temperaturen. Als zodanig zijn enzymatische methoden geworden prominent in het bioconversie proces. Terwijl de identificatie van de actieve cellulasen van bacteriën en schimmels geïsoleerd is enigszins effectief, de overgrote meerderheid van de microben in de natuur te weerstaan ​​laboratorium teelt. Milieu-genoom, ook wel bekend als metagenomic, screening benaderingen zijn een grote belofte in het overbruggen van de kloof teelt in de zoektocht naar nieuwe bioconversie enzymen. Metagenomic screening benaderingen met succes hersteld roman cellulasen uit een omgeving net zo gevarieerd als de bodem ^2, buffels pens ³ en de termiet achterste gut ⁴ met behulp van carboxymethylcellulose (CMC) agarplaten gekleurd met congo rode kleurstof (gebaseerd op de methode van Teather en Wood ^5). Echter, de CMC methode is beperkt in de doorvoer, is niet kwantitatief en manifesteert zich een lage signaal-ruisverhouding ^6. Andere methoden zijn gemeld ^{van 7,8,} maar elk gebruik een agarplaat-gebaseerde test, hetgeen ongewenst is voor high-throughput screening van grote insert genomische bibliotheken. Hier presenteren wij een oplossing op basis van het scherm voor het cellulase-activiteit met behulp van een chromogene dinitrofenol (DNP)-cellobioside substraat ^9. Onze bibliotheek werd gekloneerd in de pCC1 Copy Control fosmid voor het testen van de gevoeligheid te verhogen door middel van copy number inductie ^10. De methode maakt gebruik van een-pot chemie in 384-wells microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing die als een absorptie meting. Deze uitlezing is kwantitatief, gevoelig en geautomatiseerd met een doorvoersnelheid van maximaal 100X 384-well platen per dag met behulp van een vloeistof handler en plaat lezer met aangehechte stapelsysteem.

Protocol

Vóór het begin van dit protocol, moet u uw metagenomic bibliotheek die is opgeslagen in een 384 wells plaat-formaat. In ons onderzoek gebruikten we de pCC1 kopie controle fosmid vector in combinatie met faag T1-resistente TransforMax EPI300-T1 ^R E. coli-cellen als de bibliotheek gastheer en opgeslagen onze borden bij -80 ° C ^11.

1. Replicatie van de Metagenomic Bibliotheek Platen

1. Ontdooi de platen met uw bibliotheek bij 37 ° C gedurende ongeveer 20 minuten, of totdat alle putten zijn ontdooid.
2. Gebruik het UV-licht steriliseren-functie op de qPix2 om de robot te steriliseren gedurende 15 ....

Discussion

Een high throughput scherm voor de snelle detectie van cellulolytische activiteit van een grote insert genome DNA metagenomic bibliotheek expressie gebracht in E. coli is beschreven in dit protocol. Deze methode is een verbetering ten opzichte van de CMC / Congo Red assay vaak gebruikt in de literatuur. Het is oplossing gebaseerd, en maakt het mogelijk voor een-pot chemie screening in 384-well platen, met de uiteindelijke uitvoer als absorptie metingen van een plaat lezer waardoor kwantitatieve analyse. De auto.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qPix2	Genetix		With 384-pin gridding head
qFill3	Genetix		With 384-well manifold
Varioskan	Thermo Fisher Scientific, Inc.
RapidStak	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Connected to Varioskan
Micro90 Detergent	Cole-Parmer	18100-00	Diluted to 2% in water
Ethanol	Major Lab Supplier		Diluted to 80% in water
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	12.5mg/mL in ethanol
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-2	25g/L, autoclaved
384-well flat bottom plates	Corning	3680
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	100mg/mL in water
Potassium Acetate	Fisher Scientific	P171	50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253	In TE buffer solution, 100mM
EDTA disodium salt	Sigma-Aldrich	E5134	In TE buffer solution, 10mM
2,4-dinitrophenyl cellobioside			Provided by Dr. Steve Withers, UBC
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418