Evaluatie van de remming van virusverspreiding via genoom-silencing door microRNA-mimics

Samenvatting

Bron: Ruiz, A. J. and Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (2017)

Deze video demonstreert het gebruik van synthetische microRNA-mimics om virale replicatie in gekweekte epitheelachtige cellen selectief te remmen. Er wordt belicht hoe microRNA-gestuurde genoom silencing de verspreiding van het virus kan blokkeren en de target-specificiteit kan bevestigen via een downstream infectiviteitsanalyse.

Protocol

1. Evaluatie van de specificiteit van microRNA-targeting: Virusverspreidingsassay met synthetische microRNA-mimics

OPMERKING: Het gebruik van een synthetische microRNA-mimic wordt uitgevoerd om de specificiteit van de microRNA:microRNA-doelwitinteractie aan te tonen.

1. Voeg voor elke assay een mock-transfectie, een negatieve controle-microRNA-mimic en enkel experimentele microRNA-mimic controles toe om microRNA-gemedieerde toxiciteit te evalueren. Het is daarnaast ideaal om een positieve controle op te nemen (bijv. een microRNA-targetgen of -genoom), aangezien een lage transfectie-efficiëntie van microRNA-mimics kan leiden tot fout-negatieve resultaten.
2. Zaai H1-HeLa-cellen uit in een 96-wells weefselkweekplaat, zodanig dat ze op het moment van transfectie (24 u na het uitplaten) 80-90% confluent zijn. Zaai de cellen uit in DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) aangevuld met 10% foetaal runderserum in een volume van 0,1 mL per well.
   OPMERKING: Voer deze assay uit in cellen die permissief zijn voor virale replicatie en die de cognate microRNA's niet tot expressie brengen.
3. Breng de transfectiereagentia op kamertemperatuur. Meng 9 µL serumvrij medium, een microRNA-mimic-stock voor een eindconcentratie van 200 nM per well, 0,18 µL boost-reagent en 0,18 µL transfectiereagent. Incubeer het mengsel 2-5 min op kamertemperatuur.
   OPMERKING: De vermelde volumes zijn per well. Het wordt aanbevolen om een mastermix te maken voor de transfectie van alle wells om de consistentie te waarborgen en pipetteerfouten te minimaliseren. De optimale concentratie van de microRNA-mimic kan variëren. Raadpleeg de instructies van de fabrikant bij de microRNA-mimic voor een geschikte startconcentratie. Deze ligt doorgaans tussen de 5-200 nM eindconcentraties.
4. Suig het medium uit de wells af en voeg 92 µL vers compleet medium toe.
   OPMERKING: Indien er een aanzienlijk aantal monsters is, dient deze stap te worden voltooid voordat de transfectie-oplossing wordt bereid; bewaar de plaat vervolgens bij 37 °C tot gebruik.
5. Voeg het volledige transfectiemengsel druppelgewijs toe aan de cellen.
6. Incubeer 6 u bij 37 °C.
7. Infecteer elke well met een lage MOI (Multiplicity of infection) om ervoor te zorgen dat slechts een klein percentage cellen wordt geïnfecteerd, zodat de verspreiding van het virus kan worden geanalyseerd. Dit protocol maakt gebruik van een MOI van 0,2.
   1. Verdun virusstocks in serumvrij medium tot een concentratie van MOI = 0,2 per 100 µL. Verwijder het medium uit de wells en voeg 100 µL virusverdunning per well toe.
   2. Incubeer 2 u bij 37 °C.
8. Suig het medium uit elke well af en voeg 100 µL vers compleet medium toe.
9. Incubeer 20-22 u bij 37 °C.
10. Bepaal de virustitratie in de supernatanten.
    1. Verzamel het supernatant uit elke well en vervang dit door 100 µL vers compleet medium.
       OPMERKING: Bij gebruik van suspensiecellen dient het cell pellet uit de volgende stap opnieuw te worden gesuspendeerd in 100 µL vers compleet medium en teruggeplaatst te worden in de monsterwell voor de viabiliteitsassay.
    2. Verwijder cellulair debris uit de verzamelde supernatanten door te centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
    3. Overbreng het geklaarde supernatant naar een nieuwe buis en titreer het infectieuze virus op permissieve cellen die de cognate microRNA's niet tot expressie brengen. 
       OPMERKING: Houd alle monsters op ijs om verlies van infectiviteit te voorkomen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Nucleasevrij water	Fisher Scientific	AM9938
TransIT-2020 Transfectiereagens	Mirus	MIR 5404
TransIT-mRNA Transfectiereagens	Mirus	MIR 2225
2 mL Schroefdopbuisjes	Sarstedt	72.694.005
MicroRNA mimics	Dharmacon	Varied
MTT Celproliferatie-assay	ATCC	30-1010K