Generatie van een recombinant mazelenvirus dat een immunostimulerend eiwit codeert

Samenvatting

Bron: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)

Deze video demonstreert de generatie van recombinante mazelvirussen met behulp van liposomen om plasmiden die het virale antigenoom en essentiële helper-eiwitten coderen, af te leveren in producentencellen. Het getranscribeerde en gerepliceerde RNA leidt tot de vorming van virale partikels die immunostimulerende en fluorescerende reporter-eiwitten tot expressie brengen. Fluorescentiemicroscopie wordt vervolgens gebruikt om de vorming van syncytia te visualiseren, wat de succesvolle productie van het recombinante virus bevestigt.

Protocol

OPMERKING: [O], [P] en [M] geven subsecties aan die respectievelijk van toepassing zijn op: oncolytische virussen (OVs) in het algemeen, (de meeste) paramyxovirussen of uitsluitend het mazelenvirus (MV). [B] geeft secties aan die specifiek zijn voor bispecifieke T-cel-engager (BTE) transgenen.

1 Kloneren van transgenen die immunomodulatoren coderen in mazelenvirusvectoren

1. [O] Ontwerp de insert-sequentie.
   1. [O] Bepaal een immunomodulator van belang op basis van literatuuronderzoek of explorerende gegevens, zoals genetische screens, en leid de relevante complementaire DNA (cDNA)-sequentie af uit geschikte databases zoals GenBank, het European Nucleotide Archive of het internationale ImMunoGeneTics informatiesysteem (IMGT).
   2. [O] Voeg aanvullende kenmerken toe aan de transgeensequentie (Figuur 1). Een voorafgaande Kozak-sequentie en soortspecifieke codonoptimalisatie kunnen de expressie verbeteren. Signaalsequenties zijn vereist voor secretie. Voeg sequenties toe die N- en/of C-terminale proteinetags coderen voor detectie en zuivering. Voeg restrictieplaatsen toe voor insertie in de vector.
      OPMERKING: [M] Aanvullende transcriptie-eenheden (ATU's) die start- en stopsignalen voor het MV-polymerasegen bevatten, zijn noodzakelijk voor transgeenexpressie vanuit recombinante MV-genomen. Geschikte anti-genomische cDNA-vectoren, aangestuurd door cytomegalovirus (CMV)-promotoren en bevattend ATU's met unieke restrictieplaatsen voor de introductie van positief-sense transgenen op gedefinieerde posities, zijn eerder ontwikkeld. [P] Een adequate positionering van het transgeen is cruciaal, aangezien dit de virale replicatie en de transgeenexpressie beïnvloedt vanwege de expressiegradiënt die typisch is voor paramyxovirussen. Introductie in een ATU dicht bij het 3'-uiteinde van het anti-genoom (bijv. in de leader-positie of stroomafwaarts van het P-gen) resulteert over het algemeen in een hoge transgeenexpressie ten koste van een verminderde virale replicatie. Verhoogde replicatie en lagere niveaus van transgeenexpressie kunnen worden verwacht bij gebruik van de ATU stroomafwaarts van het H-gen. Verpakking van het genoom van verschillende paramyxovirussen, inclusief het mazelenvirus, vereist binding van zes nucleotiden door elk nucleocapside-eiwit. Zorg bij de insertie van transgenen in dergelijke virussen dat het aantal nucleotiden van het volledige genoom deelbaar is door zes. Dit wordt ook wel de "regel van zes" genoemd. Voeg indien nodig extra nucleotiden toe in de insert (stroomopwaarts van de Kozak-sequentie of stroomafwaarts van het stopcodon) zonder leesraamverschuivingen of voortijdige stopcodons te introduceren. [M] Vermijd specifieke sequenties in het transgeen die lijken op MV-genstartsignalen (AGGRNCMARGW) en stopsignalen (RTTAWANAAAA) en RNA-editingsequenties (AAAAAGGG).
   3. [O] Koop oligonucleotiden van de gewenste sequentie of stel deze samen uit beschikbare sequenties met behulp van standaard moleculaire klonering.
      OPMERKING: [O] Ontwerp voor polymerasekettingreactie (PCR)-amplificatie van het transgeen een forward primer inclusief de stroomopwaartse restrictieplaats en de eerste 15-20 nucleotiden van de insert, en een reverse primer inclusief de laatste 15-20 nucleotiden van de insert gevolgd door de stroomafwaartse restrictieplaats.
2. [O] Cloneer de insert in DNA dat het virale (anti-)genoom codeert.
   1. [O] Cloneer de insert in DNA-vectoren of DNA-anti-genomen van RNA-virussen via standaard moleculaire kloneringstechnieken (d.w.z. enzymatische restrictie gevolgd door DNA-ligatie).
      1. [O] Voorkom religatie van de vector door gebruik te maken van niet-compatibele restrictieplaatsen of door defosforylering voorafgaand aan de ligatie.
      2. [O] Isoleer het ligatieproduct via agarosegelelektroforese en daaropvolgende gelzuivering met behulp van commercieel verkrijgbare kits. In het algemeen wordt een optimale ligatie-efficiëntie bereikt bij een molaire ratio van 3:1 insert ten opzichte van vector.
   2. [O] Transformeer het ligatieproduct in competente bacteriën die geschikt zijn voor efficiënt herstel van grote plasmiden (d.w.z. voer een hitte-shock uit van E. coli) en identificeer bacteriële klonen met het correcte DNA via kolonie-PCR.
   3. [O] Isoleer geamplificeerd DNA uit een enkele bacteriële kloon met behulp van commercieel verkrijgbare DNA-preparatiekits. Bevestig de genomische integriteit door een controle-digest met geschikte restrictie-enzymen (bijv. HindIII voor MV-genomen [M]). Bevestig de correcte insertie en integriteit van het transgeen via sequencing.
      OPMERKING: [M] Voer voor transgenen die in de MV H-ATU zijn ingevoegd Sanger-sequencing uit met de volgende primers: H-9018 [forward primer, bindt aan MV-genoompositie 9018 in het H open reading frame (ORF)]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249+ (reverse primer, bindt aan MV-genoompositie 9249 in het L ORF): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. Redden van recombinante mazelvirusdeeltjes die immunomodulatoren coderen

1. [O] Genereer recombinante viruspartikels uit (anti-)genomisch DNA via transfectie van virusproducerende cellen volgens het standaardprotocol voor het betreffende virus. Volg de richtlijnen voor het werken onder steriele omstandigheden. Voer celkweken uit onder afzuigkappen, in het bijzonder alle stappen waarbij virus betrokken is in klasse II biologische veiligheidskabinetten.
   1. [M] Voor het redden van mazelenvirussen uit cDNA, plaatst u MV-producerende cellen (afgeleid van de nier van de Afrikaanse groene aap, Vero) gelijkmatig op een 6-well plaat 24 u voor transfectie. Zaai 2 x 10⁵ cellen in 2 mL Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) per well om een confluentie van 65–75% te bereiken op het moment van transfectie.
      OPMERKING: [P] Verlaag het aantal cellen als de cellen overgroeien voordat er virus-geïnduceerde syncytia worden gevormd.
   2. [P] Transfecteer de cellen met DNA dat het virale anti-genoom codeert, de vereiste helperplasmiden en, indien gewenst, een plasmide dat een fluorescent reportereiwit codeert om de transfectie-efficiëntie te beoordelen.
      1. [M] Meng 5 µg recombinant DNA dat het anti-genoom van het mazelenvirus codeert, elk 500 ng van mammale expressieplasmiden die de N- en L-eiwitten van het mazelenvirus coderen, en elk 100 ng van plasmiden die het P-eiwit coderen in een totaal volume van 200 µL DMEM. Voeg, indien gewenst voor het beoordelen van de transfectie-efficiëntie (en indien deze nog niet aanwezig is in het virale anti-genoomconstruct), 100 ng van een fluorescent reporterplasmide toe.
      2. Voeg 18,6 µL liposomaal transfectiereagens toe, meng onmiddellijk door aan de buis te tikken en incubeer gedurende 25 min bij kamertemperatuur (RT).
      3. [P] Vervang het medium door 1,8 mL DMEM met 2% FBS en 50 µg/mL kanamycine (of andere antibiotica om contaminatie te voorkomen) per well, voeg vervolgens het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de well en draai voorzichtig rond. Incubeer de cellen overnight bij 37 °C, 5% CO₂. Vervang het medium de volgende dag door 2 mL vers DMEM met 2% FBS en 50 µg/mL kanamycine; herhaal dit wanneer het medium zuur wordt.
         WAARSCHUWING: [O] Behandel cellen en materialen volgens de bioveiligheidsvoorschriften, aangezien er vanaf de transfectie tot en met de volgende stappen virus aanwezig kan zijn. Voer (potentieel) infectieus afval op de juiste wijze af.

Resultaten

Figuur 1: Schematische weergave van een maasvijrusgenoom. Enhanced green fluorescent protein (eGFP) wordt gecodeerd in een aanvullende transcriptie-eenheid stroomafwaarts van de leader (ld)-sequentie. N, P, M, F, H en L duiden respectievelijk de genen aan die coderen voor de structurele eiwitten van het maasvijrus: nucleoproteïne, P-proteïne, matrixproteïne, fusieproteïne, hemagglutinineproteïne en het grote eiwit (polymerase), die differentieel worden tot expressie gebracht zoals hierboven gevisualiseerd. Een bispecifiek T-cel-engager (BTE) transgen is ingevoegd in een aanvullende transcriptie-eenheid (ATU) stroomafwaarts van het H open leesraam. Het transgen codeert voor een immunoglobulin kappa (Igκ) leader-peptide voor efficiënte secretie, evenals influenza hemagglutinine (HA) en hexa-histidine (His) eiwit-tags voor detectie en zuivering. Genen die coderen voor de variabele zware-keten (VH) en variabele lichte-keten (VL) domeinen van antilichamen die respectievelijk CD3 en CD20 targeten, zijn verbonden via peptide-linkersequenties bestaande uit glycine (G) en serine (S) residuen. De transgen-sequentie wordt voorafgegaan door een Kozak-sequentie. Stroomafwaarts van de coderende regio zijn extra nucleotiden toegevoegd als voorbeeld om te voldoen aan de 'rule of six'. De insert-cassette wordt geflankeerd door twee restrictieplaatsen die insertie in de betreffende ATU mogelijk maken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit	Roche Life Science, Mannheim, Germany	4898117001
CloneJET PCR Cloning Kit	Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot	K1231
Agarose	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A9539-500G
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN, Hilden, Germany	28704
NEB 10-beta Competent E. coli	New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany	C3019I
QIAquick Miniprep Kit	QIAGEN, Hilden, Germany	27104
Restrictie-enzym HindIII-HF	New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany	R3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021
Fetaal runderserum (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500
FugeneHD	Promega, Mannheim, Germany	E2311	kan worden vervangen door een transfectiereagens naar keuze
Kanamycine	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	K0129
Vero-cellen	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81
6-well platen	Neolab, Heidelberg, Germany	353046