Productie en oogsten van therapeutische virus-producerende epitheelcellen

Samenvatting

Bron: Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Deze video demonstreert het proces van het infecteren van ni epitheelcellen met genetisch gemodificeerde virussen voor hun productie en het oogsten ervan om virale replicatie te bestuderen.

Protocol

1. Bepalen van de replicatieve en cytotoxische capaciteiten van virale vectoren die immunomodulatoren coderen

Vergelijk de replicatiekinetiek van het gegenereerde recombinante virus en de ongewijzigde vector met één-staps of meer-staps groeicurves (GCs). Voor één-staps GCs wordt het virale nageslacht beoordeeld na gelijktijdige infectie van alle cellen (theoretisch 100% infectie). Meer-staps GCs beginnen bij een laag percentage geïnfecteerde cellen om meerdere ronden van virusreplicatie te volgen.

1. Zaai voor de analyse van de replicatiekinetiek van het mazelenvirus 1 x 10⁵ Vero-cellen in 1 mL DMEM (dulbecco’s modified eagle medium) met 10% FBS (foetaal runderserum) per well op 12-wells platen, één dag vóór de infectie. Plateer voor elk gewenst tijdstip ten minste twee wells als technische replicates.
2. Infecteer de cellen met het virus bij een lage MOI (multiplicity of infection) voor multi-stap of bij een hoge MOI voor één-stap GCs (respectievelijk 0,03 en 3 voor MV of mazelenvirus) replicatie op Vero-cellen. Vervang het medium door 300 µL serumvrij medium dat de respectievelijke hoeveelheid virus bevat en incubeer gedurende ten minste 2 h bij 37 °C en 5% CO₂. Verwijder het inoculum, voeg 1 mL DMEM met 10% FBS toe en zet de incubatie voort.
3. Oogst op relevante tijdstippen, zoals 12, 24, 36, 48, 72 en 96 h na infectie, het virale nageslacht door de cellen direct in het medium te schrapen. Draag de inhoud van elke well over naar een individuele buis, vries deze direct in vloeibare stikstof in (snap-freeze) en bewaar bij -80 °C tot aan de titratie.
   OPMERKING: Replicate-monsters kunnen in deze stap worden samengevoegd voor de analyse van de gemiddelde titers.
4. Verzamel monsters van alle tijdstippen. Ontdooi deze gelijktijdig bij 37 °C voor de bepaling van het virale nageslacht. Vortex en pelletteer celresten door centrifugatie gedurende 5 min bij 2.500 x g en 4 °C.
5. Bereken de gemiddelde titers van elk construct en tijdstip zoals hierboven beschreven. Zet de titers uit tegen de tijd. Vergelijk de groeicurves van vectoren met en zonder ingevoegde transgenen, met verschillende transgenen of met transgenen die op verschillende posities zijn ingevoegd (zie Figuur 1).

Resultaten

Figuur 1: Replicatiekinetiek en lytische activiteit van recombinante mazelenvirussen. (A) Eénstaps groeicurves werden gegenereerd na infectie van Vero-cellen met ongewijzigd oncolytisch mazelenvirus (MV) of mazelenvirus dat een bispecifieke T-cel-engager codeert (MV-H-mCD3xhCD20) bij een MOI van 1. Titers van virale nakomelingen werden geëvalueerd op aangewezen tijdstippen na infectie, wat wijst op vergelijkbare virusreplicatiekinetiek. Gemiddelden en standaarddeviaties van acht monsters (vier technische replica's van elk van de twee biologische replica's per tijdstip) worden weergegeven. (B) De celviabiliteit werd beoordeeld op MC38 murine colorectale carcinoomcellen die stabiel het menselijk carcinoembryonaal antigeen en de MV-receptor CD46 tot expressie brengen (MC38-CEA-CD46) na inoculatie met alleen medium (mock) of de aangegeven virussen bij een MOI van 1. De XTT-celviabiliteitsassay werd uitgevoerd op de aangegeven tijdstippen. Een afname in celviabiliteit werd waargenomen op eerdere tijdstippen voor de ongewijzigde vector. Waarden van boven de 100%, zoals berekend voor MV-H-mCD3xhCD20 op het tijdstip van 12 h, worden vaak kort na infectie waargenomen, wat kan worden toegeschreven aan cellulaire stress of cel-afgeleide factoren aanwezig in de virussuspensie. Gemiddelde waarden plus standaarddeviaties van drie technische replica's worden getoond voor elk tijdstip.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021	Gebruikt voor het uitplaatten en infecteren van Vero-cellen
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500	Voor supplementatie van DMEM
Vero-cellen	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81	Gastcellen voor propagatie en assay van het mazelenvirus
12-wells platen	Neolab, Heidelberg, Germany	353043	Voor het uitplaatten van Vero-cellen (1 × 10⁵ per well)
Opti-MEM (serumvrij medium)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	31985070	Voor de virusinfectiestap (serumvrije incubatie)
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	14190-094	Voor het wassen en de bereiding van medium
Cell lifter	Corning, Reynosa, Mexico	3008	Gebruikt voor het afschrapen van geïnfecteerde cellen bij oogst
50 mL buizen	nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany	02-572-3001	Voor monstername en centrifugatie
Vloeibare stikstof	—	—	Voor het snap-freezen van geoogste virusmonsters
Centrifuge (geschikt voor 2,500 × g)	—	—	Voor het pelletiseren van celresten
XTT Cell Viability Kit (Colorimetric Cell Viability Kit III)	PromoKine, Heidelberg, Germany	PK-CA20-300-1000	Bevat XTT-reagens; voor cytotoxiciteitsmeting
96-wells platen, vlakke bodem	Neolab, Heidelberg, Germany	353072	Voor absorbentiemeting bij 450 nm
Spectrofotometer / Microplate reader	—	—	Voor het meten van de optische absorbentie bij 450 nm (referentie 630 nm)
Kooldioxide-incubator	—	—	37 °C, 5% CO₂ voor alle celincubaties