Evaluatie van de immunomodulerende activiteit van een viraal gecodeerde bispecifieke T-cel-engager

Samenvatting

Bron: Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Deze video demonstreert een celgebaseerde assay om de doelspecifieke immunomodulerende activiteit van een viraal gecodeerde bispecifieke T-cel-engager (BTE) te evalueren. De BTE koppelt tumorcellen die een doelreceptor tot expressie brengen aan T-cellen, waardoor tumorlyse en enzymvrijgave worden getriggerd. Een colorimetrische uitlezing, gebaseerd op substraatconversie, geeft de T-celactivatie aan. Een hogere kleurintensiteit in het testmonster bevestigt BTE-gemedieerde, receptorspecifieke immuuninteractie.

Protocol

1. Beoordeel de immunologische functionaliteit van geïsoleerde immunomodulatoren.
   1. In het volgende wordt in detail beschreven hoe door bispecifieke T-cel-engagers (BTE) geïnduceerde, cel-gemedieerde cytotoxiciteit kan worden geëvalueerd met een lactaatdehydrogenase (LDH)-release-assay.
      1. Bepaal de condities die tijdens het experiment getest moeten worden (zie Figuur 1 als voorbeeld). Tijdspunten (uren tot dagen), concentraties van de immunomodulator (pg/mL tot µg/mL) en ratio's effectorcel ten opzichte van doelcel (E:T) (bijvoorbeeld tussen 1:50 en 50:1) kunnen worden gevarieerd. Bereid monsters altijd in triplicaat voor.
      2. Neem monsters zonder BTE-eiwit en zonder effectorcellen op, controles voor spontane LDH-release van de enkelvoudige celtypen (Tsp en Esp), een controle voor maximale lyse van doelcellen (Tmax) waarbij detergent wordt toegevoegd vóór de uitlezing, een controle met enkel medium en een volumcontrole voor Tmax.
         OPMERKING: De benodigde aantallen doelcellen en incubatietijden kunnen variëren. Voer initiële testruns uit zonder effectorcellen en immunomodulatoren om de optimale parameters te bepalen. Neem Tsp- en Tmax-monsters en de bijbehorende controles op om verschillende celgetallen en tijdspunten te beoordelen.
      3. Isoleer immuun-effectorcellen (bijv. door dichtheidsgradiëntcentrifugatie van menselijk bloed om perifere bloedmononucleaire cellen (PBMCs) te verkrijgen of door negatieve selectie van murine T-cellen uit muis-splenocyten).
      4. Zaai doelcellen (bijv. 5 x 10³ per well) uit in een 96-well plaat met U-bodem.
      5. Voeg het geïsoleerde eiwit in de gewenste concentraties toe aan de respectieve monsters. Voeg immuun-effectorcellen toe in de gewenste ratio's. Voeg medium toe tot een totaalvolume van 100 µL per well.
      6. Incubeer gedurende de vastgestelde tijdsperiode, doorgaans tussen 4 en 48 u (24 u voor niet-gestimuleerde PBMCs en 48 u voor vers geïsoleerde murine T-cellen; kortere incubatietijden kunnen gelden voor prestimuleerde immuuncellen), bij 37 °C en 5% CO₂.
      7. Voeg 45 minuten vóór het verzamelen van de monsters 10 µL van een 10x lysiselectie toe aan de wells met Tmax-monsters en de bijbehorende mediumcontroles. Zet de incubatie voort.
      8. Centrifugeer de cellen bij 250 x g gedurende 4 min. Draag 50 µL van elk supernatant over naar een 96-well plaat met vlakke bodem. Draag geen cellen over om celgebonden LDH te voorkomen.
      9. Bereid de substraatoplossing voor volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 50 µL toe aan elke well en incubeer bij kamertemperatuur [RT] in het donker gedurende 30 min of totdat de Tmax-monsters donkerrood kleuren.
      10. Voeg 50 µL stopoplossing toe aan elke well. Verwijder luchtbellen door centrifugatie gedurende 1 min bij 4.000 x g, en handmatig met een holle naald. Meet de optische absorptie bij 490 nm.
      11. Bereken de waarden voor % specifieke lyse voor elk monster.
          1. Bereken de gemiddelden voor de replica's van de mediumcontroles met en zonder lysiselectie. Trek de verkregen waarden respectievelijk af van de experimentele monsters en van de Tmax- en spontane release-controles. Gebruik deze achtergrondgecorrigeerde waarden voor verdere berekeningen.
          2. Bereken de gemiddelden voor de achtergrondgecorrigeerde Tmax-, Tsp- en Esp-controles. Met behulp van deze gemiddelde waarden geeft de volgende vergelijking het percentage specifieke lyse voor elk monster:
             
          3. Zet de waarden voor % specifieke lyse uit tegen de eiwitconcentratie of de E:T-ratio en vergelijk deze met de niet-targeterende controlemonsters.

Resultaten

Figuur 1: Cytotoxische activiteit van door het mazelenvirus gecodeerde BTE's. Doelwit-tumorencellen (5 x 10³ B16-CD20-CD46 cellen per well) werden geïncubeerd met muizen T-cellen in een ratio van 1:50. BTE's (bispecific T-cell engagers), eerder gezuiverd uit het supernatant van MV(mazelenvirus)-H-mCD3xhCD20-geïnfecteerde cellen, werden toegevoegd in de aangegeven concentraties. De relatieve lyse van doelwitcellen werd na 48 h beoordeeld met een LDH-release assay. Cellen die het BTE-doelwitantigeen misten (B16-CD46), dienden als referentie om de antigeenspecifieke cytotoxiciteit te evalueren. Gemiddelden plus standaarddeviaties van drie technische replica's per monster worden getoond. Cellen die het doelwitantigeen tot expressie brachten, werden specifiek gelyseerd op een BTE-concentratieafhankelijke wijze. De zuiverheid van het BTE-product en de expressieniveaus van het doelwitantigeen beïnvloeden de celdoding. In het huidige voorbeeld werd een specifieke celdoding van 15% bereikt bij een relatief hoge BTE-concentratie van 1 µg/mL. Dit is een typische waarde voor een dergelijke experimentele opzet met lange co-incubatietijden en suboptimale T-celkweekcondities. In andere settings werd tot 60% specifieke doding bereikt met BTE's gezuiverd uit MV-geïnfecteerde supernatanten, waarbij een plateau werd bereikt bij BTE-concentraties van 100 ng/mL en hoger. Dit geeft aan dat, contra-intuïtief, de limiet van deze assay minder is dan 100% specifieke doding, wat kan worden verklaard door verschillende groeikinetieken in Tmax-controles vergeleken met co-kweekmonsters.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Duitsland	31966-021
Foetaal runderserum (FBS)	Biosera, Boussens, Frankrijk	FB-1280/500
Kanamycine	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Duitsland	K0129
B16-CD46/ B16-CD20-CD46	J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg		op aanvraag beschikbaar
Colorimetrische Cell Viability Kit III (XTT)	PromoKine, Heidelberg, Duitsland	PK-CA20-300-1000	bevat XTT-reagens
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Duitsland	14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin Columns	QIAGEN, Hilden, Duitsland	31014
96-wellsplaten, U-bodem	TPP, Trasadingen, Zwitserland	92097
96-wells platen, vlakke bodem	Neolab, Heidelberg, Duitsland	353072