Fluorescentiegebaseerde sortering van individuele viruspartikels voor genomische analyse

Samenvatting

Bron: Zeigler Allen, L., et al. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'. J. Vis. Exp. (2013).

Deze video demonstreert hoe flowcytometrie de isolatie van individuele, genoombevattende virussen uit gemengde populaties mogelijk maakt via fluorescentiegebaseerde detectie en nauwkeurige partikelsortering, gevolgd door inbedding in agarose voor daaropvolgende genomische karakterisering.

Protocol

1. Bereiding van virale suspensies

Bereid vóór de isolatie van individuele virionen via flowcytometrie niet-gefixeerde virale suspensies.

1. Isoleer virale deeltjes met behulp van eerder vastgestelde protocollen en zorg ervoor dat de uiteindelijke virale suspensie zich bevindt in 0,1 μm-gefiltreerde TE (Tris-EDTA, pH 8). Wij raden het gebruik van tangential flow filtration (TFF)-methoden aan, hoewel er ook andere methoden zijn ontwikkeld die gebruikmaken van chemische flocculatie.
2. Bepaal het aantal virale deeltjes met behulp van vastgestelde protocollen, bijvoorbeeld via epifluorescentie 8-10 of flowcytometrie.
3. Verdeel de virale suspensie in twee Eppendorf-buisjes (een eindvolume van 1.000 μl wordt aanbevolen).

2. Flowcytometrie

1. Om virussen te sorteren met de BD FACSAria II Flow Cytometer uitgerust met een aangepaste Forward Scatter PMT (FSC PMT), worden de virale deeltjes verdund in 0,1 μm-gefilterd TE, pH 8,0 tot een geschikte titer voor een eventrate van 200 events sec^-1.
2. Stel de drempelwaarden (thresholds) in om de signaal-ruisverhoudingen te maximaliseren; voor een mengsel met T4- en lambdafage-deeltjes worden bijvoorbeeld de volgende waarden aanbevolen: FSC PMT op 1.000 en SSC op 200.
3. Analyseer 100 μl "blank" monsters bestaande uit enkel 1) 0,1 μm-gefilterd TE en 2) 0,1 μm-gefilterd TE en SybrGreen1 in een 1e-4 verdunning van de stock (10.000X).
4. Analyseer een kleine aliquot (100 μl wordt aanbevolen) van de niet-gekleurde virale suspensie om de achtergrond te bepalen, gevolgd door de gekleurde virale suspensie (SybrGreen1 in een 1e-4 verdunning van de stock), tot een totaal van 5.000 events per monster. Dit dient om de concentratie te controleren en, indien nodig, de sorteer-gates aan te passen voorafgaand aan de sortering. Wij raden een nauwe gate aan in het centrum van de virale deeltjes. Daarnaast gebruiken we de SYBR Green- en FSC PMT-plot voor het genereren van de gates.
5. Voeg 5 μl van 1% low melting point (LMP) agarose (in TBE-buffer) afgekoeld tot 37 °C toe aan elke well op een polytetrafluoroethyleen (PTFE) microscopische glaasje (Electron Microscopy Sciences).
6. Plaats het PTFE microscopische glaasje in de flowcytometer om de gesorteerde virale deeltjes op te vangen.
7. Begin met het sorteren van SYBR Green-gekleurde virale deeltjes direct op het PTFE-glaasje met LMP-agarose. Wij raden aan om in sommige wells 10 of meer events (virale deeltjes) te sorteren om de bepaling van de diepte van de virussen tijdens confocale laserscanmicroscopie (CSLM) te vergemakkelijken.
8. Verwijder na voltooiing van de sortering het glaasje uit de flowcytometer en voeg nogmaals 5 μl LMP-agarose afgekoeld tot 37 °C toe aan elke well om het virale deeltel(en) in te bedden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1X TE-buffer	Invitrogen	12090-015
Buffer-verzadigd fenol	Invitrogen	15513-039
LMP-agarose	Invitrogen	16520100
PTFE-microscoopglasplaatje	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 wells, 4 mm diameter
β-agarase	New England Biolabs	M0392S