Herstel van infectieuze virionen uit cellen getransfecteerd met synthetisch RNA afgeleid van een bacterieel kunstmatig chromosoom

Samenvatting

Bron: Yun, S. et al. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (2015)

Deze video demonstreert het herstel van het infectieuze Japanse encefalitisvirus uit synthetisch RNA, getranscribeerd vanuit een bacterieel artificieel chromosoomklon. Er wordt getoond hoe cellen worden geëlectroporeerd met het synthetische RNA, waardoor het virale genoom de productie van nieuwe virionen kan sturen. De resulterende plaques die ontstaan in geïnfecteerde cellagen bevestigen het succesvol herstel van het infectieuze virus.

Protocol

1. Bepaal de RNA-infectiviteit en de virusopbrengst

1. Kweek baby hamster kidney-21 (BHK-21) cellen in 150 mm kweekschalen bij een dichtheid van 3 × 10⁶ cellen/schaal gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO₂.
   OPMERKING: Houd de BHK-21 cellen in stand in alpha minimum essential medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM glutamine, vitaminen en penicilline/streptomycine.
2. Spoel de cellaag met 10 ml koude Oplossing A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄ en 1,5 mM KH₂PO₄). Los de cellen van de schalen door behandeling met 4 ml trypsine-ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (0,25%) en verzamel deze door centrifugatie bij 270 × g in een tafelcentrifuge gedurende 2 min.
3. Resuspendeer de celpellet met 50 ml koude Oplossing A in een conische buis van 50 ml en centrifugeer de celsuspensie bij 270 × g gedurende 2 min. Herhaal deze wasprocedure drie keer; resuspendeer de celpellet na de laatste wasbeurt bij een dichtheid van 2 × 10⁷ cellen/ml in Oplossing A.
4. Meng een aliquot van 400 µl celsuspensie met 2 µg synthetisch RNA in een cuvet met een tussenruimte van 2 mm, en electroporeer het mengsel direct met een electroporator onder optimale electroporatiecondities: 980 V, een pulslengte van 99 µsec en 5 pulsen (Figuur 1C).
5. Laat de geëlectroporeerde cellen 10 min op kamertemperatuur (RT) staan en breng ze over naar een microbuisje van 1,7 ml met 600 µl compleet kweekmedium.
6. Maak een 10-voudige seriële verdunningsreeks van de geëlectroporeerde cellen in 1 ml compleet kweekmedium en plateer een aliquot van 100 µl van elke verdunning op de cellagen van niet-geëlectroporeerde BHK-21 cellen (5 × 10⁵) in een 6-well plaat.
7. Bedek de cellen na 4-6 uur incubatie met 0,5% agarose in minimal essential medium met 10% foetaal runderserum. Incubeer de platen 4 dagen bij 37 °C met 5% CO₂.
8. Visualiseer de infectieuze centra (plaques) door fixatie met 7% formaldehyde en kleuring met 1% kristalviolet in 5% ethanol (Figuur 2A).
   1. Optioneel: Onderzoek de RNA-geëlectroporeerde cellen 18-20 uur na transfectie op expressie van het Japanese encephalitis virus (JEV) eiwit via immunofluorescentie-assays (Figuur 2B), en oogst de supernatanten van de RNA-geëlectroporeerde cellen 22 en 40 uur na transfectie voor virustitratie via plaque-assays (Figuur 2C).

Resultaten

Figuur 1. Overzicht van het terugwinnen van infectieuze virussen uit een volledige JEV SA₁₄-14-2 complementaire DNA (cDNA) geassembleerd in een bacterieel artificieel chromosoom (BAC). (A) Linearisatie van het cDNA-template. De volledige JEV BAC wordt geknipt met XbaI en behandeld met mungboon-nuclease (MBN). (B) Synthese van de RNA-transcripten. Het gelineariseerde cDNA wordt getranscribeerd door SP6 RNA-polymerase in de aanwezigheid van de m⁷G(5')ppp(5')A cap-analoog. (C) Terugwinning van de synthetische JEVs. De in vitro getranscribeerde RNA's worden getransfecteerd in BHK-21-cellen via electroporatie, wat een hoge titer van synthetisch virus genereert.

Figuur 2. Specifieke infectiviteit van de synthetische RNA's getranscribeerd uit een full-length JEV BAC en het herstel van het synthetische virus. BHK-21 cellen zijn mock-geelectroporeerd (Mock) of geelectroporeerd met de RNA-transcripten afgeleid van elk van de twee onafhankelijke klonen van de full-length JEV BAC (Cl.1 en Cl.2). (A) RNA-infectiviteit. De cellen zijn bedekt met agarose en gekleurd met kristalviolet 4 dagen na transfectie. De RNA-infectiviteit is bepaald door infectious center-assays om de hoeveelheid infectieus RNA te schatten die in de cellen is geelectroporeerd (linkerpaneel). Ook worden representatieve afbeeldingen van infectious centers getoond (rechterpaneel). (B) Proteïne-expressie. De cellen zijn gekweekt in 4-well chamber slides. De virale proteïne-expressie in RNA-geelectroporeerde cellen 20 uur na transfectie (hpt) is geanalyseerd via immunofluorescentie-assays met gebruik van een primair konijn-antiserum tegen non-structureel proteïne 1 (NS1) en een secundair Cy3-geconjugeerd geit-anti-konijnen immunoglobuline G (IgG) (rood). De kernen zijn tegengekleurd met 4',6-diamidino-2-fenylindool (blauw). De immunofluorescentie-afbeeldingen zijn overgelegd op de bijbehorende differential interference contrast-afbeeldingen. (C) Virusopbrengst. De cellen zijn gekweekt in 150 mm kweekschalen. De productie van infectieuze virionen die zijn geaccumuleerd in de kweeksupernatanten van RNA-geelectroporeerde cellen 22 en 40 uur na transfectie (hpt) is onderzocht via plaque-assays.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alpha Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Agarose	Lonza	50004
Conische buis (50 mL)	VWR	21008-242
Kristalviolet	Sigma-Aldrich	C0775
Kweekschaal (150 mm)	TPP	93150
Cuvette (2-mm gap)	Harvard Apparatus	450125
Foetaal runderserum	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635	Toxisch en carcinogeen
Glutamine	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicilline/streptomycine	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P3911
Kaliumfosfaat monobasisch	Sigma-Aldrich	P9791
Zes-well plaat	TPP	92006
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S3014
Natriumfosfaat dibasisch	Sigma-Aldrich	S3264
Trypsine-EDTA (0,25%)	Life Technologies (Gibco)	25200-056
Vitaminen	Sigma-Aldrich	M6895
CO₂-incubator	Thermo Scientific	Heracell 150i
Tafelcentrifuge	Thermo Scientific	ST16R
Elektroporator	Harvard Apparatus	ECM 830