Het ontwikkelen van aangepaste Chinese hamster ovarium-host Cell Protein Testen met behulp van akoestisch vlies micropartikel Technology

Samenvatting

Ontwikkeling van op maat assays op de ViBE platform voor meer gevoelige, reproduceerbare, geautomatiseerd resulteert in complexe matrices beschreven. De universele patroon laat testen eenvoudig worden aangepast voor gebruik met aangepaste assays. Deze veelzijdigheid maakt snelle ontwikkeling en validatie van nieuwe testen of geautomatiseerde versies van bestaande manuele testen, geïllustreerd in deze video.

Samenvatting

Testen op maat voor de unieke eiwitten zijn vaak beperkt tot tijdrovende handmatige detectie en kwantificatie technieken zoals ELISA of Western blots te wijten aan de complexiteit van de ontwikkeling van alternatieve platforms. Gepatenteerde Acoustic BioScale's Membraan microdeeltje (AMMP) technologie maakt sandwich immunoassays te gemakkelijk worden ontwikkeld voor gebruik op de ViBE platform, een betere gevoeligheid, reproduceerbaarheid, en geautomatiseerde werking. Als voorbeeld, dit protocol beschrijft de procedure voor het ontwikkelen van een aangepaste Chinese hamster ovarium-Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. De algemene beginselen hier geschetst kan worden gevolgd voor de ontwikkeling van een breed scala van immunoassays.

Een AMMP test meet antigeen concentratie door het meten van veranderingen in de trillingsfrequentie wordt veroorzaakt door de binding van micropartikels om de sensor oppervlak te berekenen. Het bestaat uit vier belangrijke componenten: (1) een patroon dat een gefunctionaliseerd acht sensor chip bevat (2) antilichaam gelabeld magnetische microdeeltjes, (3) hapteen tagged antilichaam dat bindt aan het oppervlak van de gefunctionaliseerde chip (4) monsters die het antigeen van rente. BioScale De biosensor is een apparaat dat resonant acht afzonderlijke membranen met een aparte fluidisch paden bevat. De membranen verandering trillingsfrequentie in reactie op de massa zich ophoopt op het oppervlak en deze frequentie verandering is gebruikt om de hoeveelheid van de toegevoegde massa kwantificeren.

Om het gebruik te vergemakkelijken in een breed scala van immunoassays de sensor is gefunctionaliseerd met een anti-hapteen antilichaam. Assay specifieke antilichamen worden gewijzigd door de covalente conjugatie van een hapteen tag een antilichaam en biotine naar de andere. Het biotine label wordt gebruikt om het antilichaam binden aan gekoppeld magnetische korrels die, in combinatie met de hapteen-gelabeld antilichaam, worden gebruikt om de analyt te vangen in een sandwich streptavidine. Het complex bindt aan de chip door de anti-hapten/hapten interactie. Aan het einde van elke test run de sensoren worden schoongemaakt met een verdund zuur waardoor de sequentiële analyse van de kolommen van een 96-well plaat.

Hier presenteren we de methode voor het ontwikkelen van een aangepaste CHO-HCP AMMP test voor bioproces ontwikkeling. Het ontwikkelen van AMMP testen of het wijzigen van bestaande testen in AMMP testen kunnen zorgen voor betere prestaties (reproduceerbaarheid, gevoeligheid) in complexe monsters en minder operator tijd. Het protocol geeft de stappen voor de ontwikkeling en de discussie sectie reviews representatieve resultaten. Voor een meer gedetailleerde uitleg van test-optimalisatie en aanpassing parameters contact BioScale. Deze set bevat generieke bioprocess ontwikkeling assays zoals Resterende proteïne A, Product titer, en CHO-HCP.

Protocol

1. Microdeeltje Voorbereiding

1. Label antilichamen met behulp van Biotine NHS Chemie
2. Bepaling van de Graad van biotinylatie
3. Conjugaat Streptavidine Kralen met gebiotinyleerd antilichaam
   1. Resuspendeer de kralen in de originele flacon door vortexen gedurende 1-2 minuten
   2. Aliquot het gewenste volume van kralen in een microcentrifugebuis
   3. Was de kralen 3 keer met PBST:
      1. Plaats de buis met de kralen op de magneet gedurende 2 minuten
      2. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie met de buis op de magneet. Wees voorzichtig dat u de kralen te verstoren
      3. Haal de buis van de magneet en voeg 1 ml PBST
      4. Vortex gedurende 20 seconden om de kralen resuspenderen
      5. Centrifugeer gedurende 5 seconden ingedrukt om de parels uit de dop
      6. Herhaal dit twee keer 2.3.1-2.3.5 meer
   4. Na de derde plaats was de buis op de magneet en zuig de PBST
   5. Voeg gebiotinyleerd antilichaam aan de kralen en resuspenderen
   6. Indien nodig brengt het volume van de gebiotinyleerde antilichaam tot 300 pi met PBS. Als het antilichaam volume is al meer dan 300 pi voeg geen PBS
   7. Incubeer de kraal / antilichaam suspensie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op de vortex shaker of buis rotator
   8. Was drie keer met PBST zoals in stap 3.
   9. Blok kralen met gebiotinyleerd BSA
      1. Na de derde wasbeurt toe te voegen 10 ug / mg gebiotinyleerd BSA, past u het volume op 300 ul met PBS, indien nodig, en incubeer onder schudden gedurende 30 minuten
   10. Was drie keer met PBST zoals in stap 3
   11. Resuspendeer de kralen in 100 ul van PBS/0.05% BSA. Natriumazide kan worden toegevoegd voor de lange termijn opslag
4. Met behulp van standaard NHS Fluoresceïne protocollen, fluoresceinate de detector antilichaam
5. Bepalen de mate van Fluorescination

2. HCP - Ontwikkeling

1. Bereid te werken oplossingen:
   1. Fluoresceïne gelabeld antilichaam (Fl-Ab): De meeste CHO-HCP assays gebruiken Fl-Ab bij een uiteindelijke concentratie van 400 ng / mL. De FL-Ab wordt toegevoegd als ¼ van de laatste test volume, dus de concentratie van de werkende oplossing is 1,6 microgram / ml. Bereid deze oplossing door verdunnen flab voorraad met BioScale Bead / flab Diluent.
   2. Kralen: De meeste CHO-HCP assays gebruiken kralen bij een uiteindelijke concentratie van 2x10 ⁵ kralen / ml. De kraal reagens vormt ¼ van de uiteindelijke test volume, dus de concentratie van de werkende oplossing is 8x10 ⁵ kralen / ml. Bereid deze oplossing door verdunnen kraal voorraad met BioScale Bead / flab Diluent. Vortex de kraal voorraad goed om ervoor te zorgen dat alle parels worden in suspensie voorafgaand aan het verwijderen van een aliquot deel.
   3. Running Buffer: De samenstelling van het lopende buffer kan worden geoptimaliseerd voor de antilichamen gebruikt worden om de test te ontwikkelen, maar een aantal CHO-HCP testen zijn ontwikkeld met behulp van 10 mM HEPES buffer, 1% Tween, pH 7,5. BioScale heeft ontwikkeld, een additief voor de lopende buffer (meegeleverd met de development kit), die wordt toegevoegd aan de buffer tot een concentratie van 1% voor gebruik.
2. Verdunnen kalibrators en monsters met BioScale Sample Diluent.

3. ViBE System Set Up

1. Schakel de ViBE Workstation op
2. Sluit het systeem leveren en afval
3. Prime van het systeem
4. Plaats een ViBE cartridge
5. Route van de buizen
6. Bereid test template door het invullen van het blad met het label "Sample Setup". BioScale biedt de mogelijkheid om een ​​test template voor iedere ViBE Workstation test. Hierdoor kan de gebruiker te bewerken en specifieke notities op te slaan in de "Notes" vel van de sjabloon voor de verschillende assays het bijhouden van een volledig verslag van het experiment.
7. De eerste test template set up: Begin met het invullen van de tabel (linker bovenhoek) van de concentratie bereik van de normen in de test in de "Sample Setup" sheet.
8. Volgende, aanvullende informatie in de tabel in te voeren om het recht van de normen (Simple Column Lees Configuratie, Een reagens toevoegen en Two Reagent Add setups) naar de Vibe Workstation hoe lang monsters moet broeden instrueren, hoeveel volume reagens is over te dragen , hoe lang het monster accumulatie dient te zijn, en of de sensor conditionering en ontsmetting van de sondes en de cartridge nodig zijn, enz.
9. Vul de plaat lay-out.
10. Belasting monster / reagentia in platen. De ViBE zal de vereiste volumes voor het reagens plaat. Monstervolume kan variëren, maar in de helft van een totaal volume van de test 120 uL is een goed startpunt.
11. Van toepassing zijn plaat dekt. Laad de borden op werkstation dek.
12. Voer de test start up wizard, ga door wizard en start test.

4. Representatieve resultaten

Figuur 1: AMMP Sandwich Immunoassay

Op een ViBE Workstation, een AMMP test meet antigeen concentratie. Het signaal wordt gemeten wanneer de kraal-antigeen-hapteen antilichaam bindt aan de sensor door de hapteen / anti-hapteen interactie. Regeneratie brengt de sensor terug naar het begin staat door het verwijderen van de immune complexen.

Figuur 2: CHO-HCP AMMP Assay kalibratiecurve

Figuur 2 hierboven is een voorbeeld van een CHO HCP AMMP Assay kalibratiecurve. Analyse kan worden uitgevoerd in monsters uit de hele zuivering beek met inbegrip van de reactor met hoge precisie en reproduceerbaarheid.

Figuur 3: Proteïne A AMMP Assay kalibratiecurve

Figuur 3 is een calibratie curve voor een resterende Proteïne A AMMP Test, uitgevoerd met een VIBE Resterende Proteïne A Assay Kit. Dezelfde kit kan gebruikt worden voor een snellere test met een 30 minuten incubatietijd, of voor meer gevoelige resultaten en een breder dynamisch bereik met een langere incubatieperiode zonder verlies van precisie of de nauwkeurigheid, die beide zijn meestal beter is dan vergelijkbare ELISA's in van gebruikers handen

Figuur 4: Product Titer AMMP Assay

De ViBE Workstation kan ook worden gebruikt voor een product Titer test, de resultaten weergegeven in figuur 4. Anders uitgevoerd dan andere AMMP Testen, is deze test niet nodig steekproef andere behandeling dan eenvoudige verdunning, of kralen, en kwantificering is geverifieerd in "geen spin" monsters met meer dan 10 miljoen cellen over een breed scala van de levensvatbaarheid.

Figuur 5: AMMP Assay standaardcurve voor GST-Gadd34 biomarker analyse

Weergegeven in figuur 5 is een standaard curve van het signaal verkregen door de ViBE BioAnalyzer (Panel A) of met behulp van recombinant-technologie AlphaScreen GST-Gadd34. Resultaten op de ViBE platform waren ongeveer een log gevoeliger met dezelfde antilichamen. AMMP maakt gebruik van de meting van de minder grotere deeltjes geniet nog steeds uit de oplossing fase vast te leggen en detectie complex vorming.

Figuur 6: AMMP Assay standaardcurve voor GST-Gadd34 in tumormonster

In figuur 6, was de inductie van Gadd34 van CWR22 xenotransplantaties getest in de aanwezigheid of afwezigheid van een boronate proteasoom inhibitor zoals geanalyseerd door ofwel de ViBE BioAnalyzer (Panel A) of AlphaScreen (Panel B). De ViBE platform was in staat om gevoelige, reproduceerbare resultaten te produceren in de in vivo tumor xenotransplantaten terwijl het AlphaScreen signaal werd geblust met een verhoogde ug van eiwitten.

Dit voorbeeld toont de kracht van AMMP technologie in de zeer complexe monsters. Vanwege de gevoelige detectie-chip en een hoog rendement van de magneet in de buurt van de chips, kan lage aantallen van magnetische microdeeltjes efficiënt en reproduceerbaar scharrelen voor de lage abundantie doel te midden van de complexiteit van de gelyseerde cellulaire (inclusief lysis reagentia) en bloed puin.

Discussie

De voorgaande voorbeelden laten zien zeer gevoelig kwantitatieve AMMP de resultaten in complexe monsters. Deze prestatie, bij aflevering met het gemak en de controle van het formatteren van reagentia in het systeem is mogelijk voor een verscheidenheid aan toepassingen. Deze aanvragen kan specifiek voor een doel, zoals in Gadd34 in tumor, of generiek voor een spectrum van de doelen, zoals in gastheercel eiwit detectie en kwantificatie in monsters dat de zuivering beek over te steken. De lage overhead ViBE platform in combinatie met zeer flexibele AMMP biedt een krachtig instrument voor het leveren van kritische analyses.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NHS-Chromogenic-biotine of NHS-Chromogenic Biotine Labeling kit
Indien NHS-Chromogenic-biotine als reagens wordt aangeschaft, zijn de volgende aanvullende materialen vereist
Watermengbaar organisch oplosmiddel zoals dimethylsulfoxide (DMSO) of dimethylformamide (DMF)
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of een andere aminevrije buffer (pH 7 – 9)
Ontzoutingskolommen of dialyse-units voor bufferuitwisseling
Spectrofotometer die metingen kan uitvoeren bij 354 en 280 nm – voor het bepalen van eiwit- en biotineconcentraties
Biotinylated antilichaam (2-5 biotines/Ab)
Streptavidine magnetische beads	BioScale		(10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magneet voor microcentrifugebuisjes	New England Biolabs	cat # S1510S
Biotinylated BSA voor blokkeren
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)
PBS 0,1% Tween 20
Vortex
Microcentrifugehouder voor Vortex of buizenrotator
Antilichaam of eiwit dat gelabeld moet worden
NHS-Fluoresceïne of NHS-Fluoresceïne Labeling kit
Indien NHS-Fluoresceïne als reagens wordt aangeschaft, zijn de volgende aanvullende materialen vereist
Watermengbaar organisch oplosmiddel zoals dimethylsulfoxide (DMSO) of dimethylformamide (DMF)
50 mM boraat, pH 8,5 of een andere aminevrije buffer (pH 7 – 9)
Ontzoutingskolommen of dialyse-units voor bufferuitwisseling
Voor de bepaling van eiwit- en fluoresceïneconcentraties is een spectrofotometer nodig die metingen kan uitvoeren bij 493 en 280 nm.
Verdunner	BioScale		om beads en FlAb te verdunnen
Monsterverdunner	BioScale		om monsters en kalibratoren te verdunnen
Running Buffer Additive	BioScale