Een muismodel voor huid- en weke deleninfecties wordt gebruikt om de virulentiefunctie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en de immunologische respons van de gastheer te beoordelen. Hier presenteren wij een subcutaan infectiemodel voor huid- en weke deleninfecties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
MRSA vormt een wereldwijde bedreiging voor de volksgezondheid, en huid- en weke deleninfecties door MRSA zijn in de Verenigde Staten inmiddels verantwoordelijk voor meer dan de helft van alle weke deleninfecties. Onder de weke deleninfecties worden myositis, pyomyositis en necrotiserende fasciitis steeds vaker gemeld in verband met MRSA die vanuit de gemeenschap is ontstaan. Om de wisselwerking tussen MRSA en de immuniteit van de gastheer die leidt tot ernstigere infecties te begrijpen, is de beschikbaarheid van diermodellen cruciaal, aangezien deze de studie van gastheer- en bacteriële factoren mogelijk maken. Er zijn verschillende infectiemodellen geïntroduceerd om de pathogenese van S. aureus tijdens oppervlakkige huidinfecties te beoordelen. Hier beschrijven wij een subcutaan infectiemodel dat de pathologieën van de huid, het subcutane weefsel en de spieren onderzoekt.
Protocol
1. Voorbereiden van de MRSA voor infectie (twee dagen voor de infectie)
- Inoculeer een lus MRSA vanuit een stockcultuur op een bloedagarplaat (Trypticase Soy Agar (TSA)).
- Controleer het hemolyse-fenotype (een heldere zone rond elke kolonie) op de bloedagarplaat.
- Selecteer een kolonie met een hemolytisch fenotype dat consistent is met andere experimenten.
- Inoculeer de kolonie in 3 mL Todd Hewitt Broth (THB), indien nodig met het toepasselijke antibioticum, in een 15 mL buis met klikdop.
- Incubeer overnight bij 37°C met schudden op 20 rpm.
2. Voorbereiding van de muizen voor infectie (één dag vóór de infectie)
- Scheer, afhankelijk van de grootte van de muizen, de vacht van een gebied van 3 x 4 cm op de rug van de muizen.
- Breng ~5 mm3 ontharingscrème (gekocht bij een lokale drogist) aan op het geschoren gebied.
- Laat de ontharingscrème ongeveer 1 min inwerken op het huidoppervlak.
- Maak papieren handdoeken nat met ddH2O.
- Veeg de ontharingscrème af met de natte papieren handdoek.
3. Voorbereiden van de MRSA voor infectie (op de dag van infectie)
- Verdun de overnight bacteriële cultuur in een verhouding van 1:50 tot 1:100 met 10 mL voorverwarmd THB in een buis van 50 mL met schroefdop.
- Incubeer gedurende ongeveer 2,5 uur bij 37°C met schudden op 220 rpm, totdat A540 2,5 bereikt.
- Verzamel MRSA door centrifugatie bij 3.25 x g gedurende 10 min bij 4°C.
- Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer het bacteriële pellet in 10 mL Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS).
- Herhaal stap 3 en 4.
- Resuspendeer het bacteriële pellet in DPBS tot de gewenste concentratie.
- Maak seriële verdunningen van de bacteriële suspensie van 101 tot 108.
- Plateer de verdunde bacteriële suspensie op bloedagarplaten.
- Incubeer de platen overnight bij 37°C.
- Observeer en noteer het hemolytische fenotype van de inocula.
- Tel het aantal Colony Forming Units (CFU) op de plaat.
- Bereken de inocula op basis van het CFU-getal op de plaat.
4. Subcutane infectie met MRSA (op de dag van infectie en 3 dagen na infectie)
- Injecteer subcutaan 10 μL bacteriële suspensie in het geschoren gebied.
- Observeer de dieren gedurende 3 tot 5 uur na de injectie om er zeker van te zijn dat de muizen in leven zijn.
- Observeer de laesie op de rug van de dieren dagelijks en noteer de oppervlakte van de laesie dagelijks indien nodig. De observatie van de laesie moet het vastleggen van de grootte en morfologie van de laesie omvatten. Zowel huid- als spierlaesies worden gekwantificeerd door de lengte en breedte van de laesie met elkaar te vermenigvuldigen. Onregelmatig gevormde laesies moeten worden opgedeeld in kleinere symmetrische delen, waarbij elk deel met dezelfde methode wordt gemeten. Voor laesiemetingen kan ook een computerondersteund histomorfometrisch beoordelingsprogramma worden gebruikt (ImageJ; open-source beschikbaar via de NIH op http://rsb.info.nih.gov/ij/) 2.
- Offer de dieren op dag 3 na infectie door inhalatie van isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie.
- Observeer en noteer de laesie op de huid.
- Maak een inkeping in de huid met een steriele schaar.
- Pel de huid voorzichtig af en observeer en noteer de laesie op de spier.
- Exciseer de laesie en ongeveer 2 - 5 mm van het omliggende gebied.
- Verzamelen van milt en nieren.
- Homogeniseer de weefsels met een weefselhomogenisator of door herhaaldelijk een zuiger van een 1 mL spuit in een microcentrifugeebuis met het weefsel en 10 μL DPBS te bewegen.
- Voeg 90 μL DPBS toe aan elke buis.
- Vortex de monsters gedurende 5 min.
- Verdun de suspensie seriëel met DPBS van 101 tot 106.
- Plaat de verdunde suspensies op THA-platen.
5. Representatieve resultaten:
- Direct na elke subcutane injectie zal een blaasje op het huidoppervlak zichtbaar zijn wanneer de infectie correct is uitgevoerd (Figuur 1A). Als er geen blaasje op het huidoppervlak wordt waargenomen, kan de injectie te diep zijn, wat de uitkomst van de infectie (laesiegrootte, CFU) kan beïnvloeden.
- De bacteriële suspensie moet seriële verdunningen ondergaan en de CFU moeten voor elk experiment op bloedagarplaten worden onderzocht. Deze stap levert belangrijke informatie op: 1) of de inocula een homogeen fenotype hebben; 2) het exacte aantal levensvatbare bacteriën voor de infectie.
- De laesies en bacteriële overleving kunnen op verschillende tijdstippen na de infectie worden beoordeeld. Hier hebben we de infectie onderzocht op dag 3 na infectie. De laesiegroottes worden geanalyseerd op het huidoppervlak (Figuur 1B: 1x 109; Figuur 1D: 1 x 107 CFU) en op het spieroppervlak (Figuur 1C: 1x 109; Figuur 1E: 1 x 107 CFU). Om de weefselschade te beoordelen, kan het laesieoppervlak worden berekend als lengte (mm) x breedte (mm) (Fig. 2 A en B). Dit resultaat kan helpen bij het bepalen van de omvang van de weefselschade veroorzaakt door een bepaalde virulentiefactor. Daarnaast worden de laesies uitgesneden, gehomogeniseerd in DPBS en uitgeplaat om het aantal CFU te kwantificeren (Figuur 2C), wat de levensvatbaarheid van de bacteriën op de infectieplaats aangeeft.
Figuur 1. De huid- en spierlaesies. CD1-muizen werden subcutaan op één flank geïnoculeerd met MRSA (LAC). Er werden foto's gemaakt op tijdstip 0 en dag 3 na infectie. (A) Tijdstip 0 na infectie (n.i.), (B)-(G) Dag 3 n.i.; B, D en F: huidlaesies; C, E en G: spierlaesies; B en C: 1x 109 geïnfecteerde CFU; D en E: 1x 107 CFU geïnfecteerd; F en G: mock.
Figuur 2. Grootte van de huidlaesie en aantal levensvatbare bacteriën op de infectieplaats op dag 3 na infectie. Huid- en spierlaesies bij CD1-muizen geïnfecteerd met MRSA (LAC). (A) Grootte van de huidlaesie. (B) Grootte van de spierlaesie. (C) Totaal CFU in weefsel. H: 1 x 109 CFU-inocula; L: 1 x 107 CFU-inocula. *: p < 0,05, Mann-Whitney-toets.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
- Het muismodel voor huid- en weke deleninfecties is een krachtig instrument voor de in vivo virulentiebeoordeling van een pathogeen. De pathogeniciteit van S. aureus bij huid- en weke deleninfecties kan variëren afhankelijk van een aantal parameters. Deze omvatten de inoculumgrootte, de bacteriële groeifase, de inbrengdiepte, de leeftijd van de muizen en de genetische achtergrond van de muis 7, 8. Bij het onderzoeken van de virulentiefunctie met behulp van dit model is het cruciaal om deze parameters te con...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenverstrengeling gemeld.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een Burroughs-Wellcome Career Award en door National Institutes of Health-beurs AI074832 aan G. Y. Liu.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| THB | VWR international | 95025-314 | |
| DPBS | Invitrogen | 21-031-CV | |
| 1 ml spuit | BD Biosciences | 309602 | |
| 27G1/2 naald | BD Biosciences | 305109 | |
| Schaapenbloedagar (TSA) | VWR international | 90004-328 |
Referenties
- Ahn, J. Y., Song, J. Y., Yun, Y. S., Jeong, G., Choi, I. S. Protection of Staphylococcus aureus-infected septic mice by suppression of early acute inflammation and enhanced antimicrobial activity by ginsan. FEMS Immunol Med Microbiol. 46, 187-197 (2006).
- Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41, 47-47 (2004).
- Hahn, B. L., Onunkwo, C. C., Watts, C. J., Sohnle, P. G. Systemic dissemination and cutaneous damage in a mouse model of staphylococcal skin infections. Microb Pathog. 47, 16-23 (2009).
- Hruz, P., Zinkernagel, A. S., Jenikova, G., Botwin, G. J., Hugot, J. P., Karin, M., Nizet, V., Eckmann, L. NOD2 contributes to cutaneous defense against Staphylococcus aureus through alpha-toxin-dependent innate immune activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12873-12878 (2009).
- Ji, Y., Zhang, B., Van, S. F., Horn, P. W. arren, Woodnutt, G., Burnham, M. K., Rosenberg, M. Identification of critical staphylococcal genes using conditional phenotypes generated by antisense RNA. Science. 293, 2266-2269 (2001).
- Somerville, G. A., Beres, S. B., Fitzgerald, J. R., DeLeo, F. R., Cole, R. L., Hoff, J. S., Musser, J. M. In vitro serial passage of Staphylococcus aureus: changes in physiology, virulence factor production, and agr nucleotide sequence. J Bacteriol. 184, 1430-1437 (2002).
- Tseng, C. W., Kyme, P., Low, J., Rocha, M. A., Alsabeh, R., Miller, L. G., Otto, M., Arditi, M., Diep, B. A., Nizet, V., Doherty, T. M., Beenhouwer, D. O., Liu, G. Y. Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin contributes to inflammation and muscle tissue injury. PLoS One. 4, e6387-e6387 (2009).
- von Kockritz-Blickwede, M., Rohde, M., Oehmcke, S., Miller, L. S., Cheung, A. L., Herwald, H., Foster, S., Medina, E. Immunological mechanisms underlying the genetic predisposition to severe Staphylococcus aureus infection in the mouse model. Am J Pathol. 173, 1657-1668 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
