Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

Samenvatting

Een muismodel voor huid- en weke deleninfecties wordt gebruikt om de virulentiefunctie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en de immunologische respons van de gastheer te beoordelen. Hier presenteren wij een subcutaan infectiemodel voor huid- en weke deleninfecties.

Samenvatting

MRSA vormt een wereldwijde bedreiging voor de volksgezondheid, en huid- en weke deleninfecties door MRSA zijn in de Verenigde Staten inmiddels verantwoordelijk voor meer dan de helft van alle weke deleninfecties. Onder de weke deleninfecties worden myositis, pyomyositis en necrotiserende fasciitis steeds vaker gemeld in verband met MRSA die vanuit de gemeenschap is ontstaan. Om de wisselwerking tussen MRSA en de immuniteit van de gastheer die leidt tot ernstigere infecties te begrijpen, is de beschikbaarheid van diermodellen cruciaal, aangezien deze de studie van gastheer- en bacteriële factoren mogelijk maken. Er zijn verschillende infectiemodellen geïntroduceerd om de pathogenese van S. aureus tijdens oppervlakkige huidinfecties te beoordelen. Hier beschrijven wij een subcutaan infectiemodel dat de pathologieën van de huid, het subcutane weefsel en de spieren onderzoekt.

Protocol

1. Voorbereiden van de MRSA voor infectie (twee dagen vóór de infectie)

1. Inoculeer een lusje MRSA vanuit een stockcultuur op een bloedagarplaat (Trypticase Soy Agar (TSA)).
2. Controleer het hemolysefenotype (een heldere zone rond elke kolonie) op de bloedagarplaat.
3. Selecteer een kolonie met een hemolytisch fenotype dat consistent is met andere experimenten.
4. Inoculeer de kolonie in 3 mL Todd Hewitt Broth (THB), indien nodig met het passende antibioticum, in een 15 mL buis met klikdop.
5. Incubeer gedurende één nacht bij 37°C met schudden op 220 rpm.

2. Voorbereiding van de muizen voor infectie (één dag vóór de infectie)

1. Scher de vacht af over een gebied van 3 x 4 cm op de rug van de muizen, afhankelijk van de grootte van de muizen.
2. Breng ~5 mm³ ontharingscrème (gekocht bij een lokale drogist) aan op het geschoren gebied.
3. Laat de ontharingscrème ongeveer 1 min inwerken op het huidoppervlak.
4. Maak papieren handdoekjes nat met ddH₂O.
5. Veeg de ontharingscrème af met het natte papieren handdoekje.

3. Voorbereiding van de MRSA voor infectie (op de dag van de infectie)

1. Verdun de overnight bacteriecultuur in een verhouding van 1:500 tot 1:1000 met 10 mL voorverwarmde THB in een buis van 50 mL met schroefdop.
2. Incubeer gedurende ongeveer 2,5 uur bij 37°C met schudden op 220 rpm, totdat A₅₄₀ 2,5 bereikt.
3. Pellet de MRSA door centrifugatie bij 3.225 x g gedurende 10 min bij 4°C.
4. Verwijder het supernatant.
5. Resuspendeer de bacteriepellet in 10 mL Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS).
6. Herhaal stap 3 en 4.
7. Resuspendeer de bacteriepellet in DPBS tot de gewenste concentratie.
8. Maak seriële verdunningen van de bacteriesuspensie van 10¹ tot 10⁸.
9. Plateer de verdunde bacteriesuspensie op bloedagarplaten.
10. Incubeer de platen overnight bij 37°C.
11. Observeer en noteer het hemolytische fenotype van de inocula.
12. Tel het aantal Colony Forming Units (CFU) op de plaat.
13. Bereken de inocula op basis van het CFU-aantal op de plaat.

4. Subcutane infectie met MRSA (op de dag van infectie en 3 dagen na infectie)

1. Injecteer subcutaan 100 μL bacteriële suspensie in het geschoren gebied.
2. Observeer de dieren gedurende 3 tot 5 uur na de injectie om er zeker van te zijn dat de muizen in leven zijn.
3. Observeer dagelijks de laesie op de rug van de dieren en noteer dagelijks de oppervlakte van de laesie wanneer dit nodig is. De observatie van de laesie moet het vastleggen van de grootte en morfologie van de laesie omvatten. Zowel huid- als spierlaesies worden gekwantificeerd door de lengte en breedte van de laesie met elkaar te vermenigvuldigen. Onregelmatig gevormde laesies moeten worden onderverdeeld in kleinere symmetrische delen, waarbij elk deel met dezelfde methode wordt gemeten. Voor laesiemetingen kan ook een computerondersteund histomorfometrisch beoordelingsprogramma worden gebruikt (ImageJ; open-source beschikbaar via de NIH op http://rsb.info.nih.gov/ij/) ².
4. Offer de dieren op dag 3 na infectie op door inhalatie van isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie.
5. Observeer en noteer de laesie op de huid.
6. Maak een inkeping in de huid met een steriele schaar.
7. Pel de huid voorzichtig af en observeer en noteer de laesie op de spier.
8. Exciteer de laesie en ongeveer 2 - 5 mm van het omliggende gebied.
9. Verzamel de milt en de nieren.
10. Homogeniseer de weefsels met een weefselhomogenisator of door herhaaldelijk een zuiger van een 1 mL spuit in een microcentrifugebuis te gebruiken die het weefsel en 100 μL DPBS bevat.
11. Voeg 900 μL DPBS toe aan elke buis.
12. Vortex de monsters gedurende 5 min.
13. Verdun de suspensie serieel met DPBS van 10¹ tot 10⁶.
14. Plateer de verdunde suspensies op THA-platen.

5. Representatieve resultaten:

1. Direct na elke subcutane injectie is een bultje op het huidoppervlak waarneembaar wanneer de infectie correct is uitgevoerd (Figuur 1A). Als er geen bultje op het huidoppervlak zichtbaar is, kan de injectie te diep zijn, wat de uitkomst van de infectie (laesiegrootte, CFU) kan beïnvloeden.
2. De bacteriële suspensie moet in serie worden verdunn en de CFU moeten voor elk experiment worden gecontroleerd op bloedagarplaten. Deze stap levert belangrijke informatie op: 1) of de inocula een homogeen fenotype hebben; 2) het exacte aantal levensvatbare bacteriën voor de infectie.
3. De laesies en de bacteriële overleving kunnen op verschillende tijdstippen na de infectie worden beoordeeld. In dit geval hebben we de infectie onderzocht op dag 3 na infectie. De laesiegroottes worden geanalyseerd op het huidoppervlak (Figuur 1B: 1x 10⁹; Figuur 1D: 1 x 10⁷ CFU) en op het spieroppervlak (Figuur 1C: 1x 10⁹; Figuur 1E: 1 x 10⁷ CFU). Voor de beoordeling van de weefselschade kan het laesieoppervlak worden gemeten als lengte (mm) x breedte (mm) (Fig. 2 A en B). Dit resultaat kan helpen bij het bepalen van de mate van weefselschade veroorzaakt door een specifieke virulentiefactor. Daarnaast worden de laesies weggesneden en gehomogeniseerd in DPBS, en vervolgens geplaat om het aantal CFU te kwantificeren (Figuur 2C), wat de levensvatbaarheid van de bacteriën op de infectieplaats aangeeft.

Figuur 1. De huid- en spierlaesies. CD1-muizen werden subcutaan op één flank geïnoculeerd met MRSA (LAC). Foto's werden genomen op tijdstip 0 en dag 3 na infectie. (A) Tijdstip 0 na infectie (n.i.), (B)-(G) Dag 3 n.i.; B, D en F: huidlaesies; C, E en G: spierlaesies; B en C: geïnfecteerd met 1x 10⁹ CFU; D en E: geïnfecteerd met 1x 10⁷ CFU; F en G: mock.

Figuur 2. Grootte van huidlaesies en aantal levensvatbare bacteriën op de infectieplaats op dag 3 na infectie. Huid- en spierlaesies bij CD1-muizen geïnfecteerd met MRSA (LAC). (A) Grootte van huidlaesies. (B) Grootte van spierlaesies. (C) Totaal CFU in weefsel. H: 1 x 10⁹ CFU inocula; L: 1 x 10⁷ CFU inocula. *: p < 0.05, Mann-Whitney test.

Discussie

1. Het muismodel voor huid- en weke deleninfecties is een krachtig instrument voor de in vivo virulentiebeoordeling van een pathogeen. De pathogeniciteit van S. aureus bij huid- en weke deleninfecties kan variëren afhankelijk van een aantal parameters. Deze omvatten de inoculumgrootte, de bacteriële groeifase, de inbrengdiepte, de leeftijd van de muizen en de genetische achtergrond van de muis ^{7, 8}. Bij het onderzoeken van de virulentiefunctie met behulp van dit model is het cruciaal om deze parameters te con...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
THB	VWR international	95025-314
DPBS	Invitrogen	21-031-CV
1 ml spuit	BD Biosciences	309602
27G1/2 naald	BD Biosciences	305109
Schaapenbloedagar (TSA)	VWR international	90004-328