$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Cultuur van de Cel en experimentele set-up
- Humane keratinocyten worden gehandhaafd als monolagen in 75 cm 2 weefselkweek kolven met 15 ml keratinocyte-SFM (K-SFM) medium (GIBCO, serum-vrij medium) aangevuld met L-glutamine (2 mM), epidermale groeifactor (5 ng / ml), runderen hypofyse-extract (40 ug / ml) en 20 mg / ml gentamicine. Cellen worden gekweekt in een bevochtigde 5% CO 2-omgeving bij 37 ° C.
- Cellen worden gezaaid in 12 x 25 cm 2 weefselkweek kolven met 5 ml van de K-SFM medium.
Eencellige suspensies worden bereid door behandeling met trypsine. Cellen worden gewassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing en geïncubeerd met een 0,05% trypsine / EDTA-oplossing voor 5-10 minuten. Wanneer de cellen beginnen te worden afgerond en ~ 30% zijn vrijstaand, is drie volumes van Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium dat 10% foetaal runderserum toegevoegd aan het trypsine te neutraliseren. De cellen worden losgemaakt door en neer te pipetteren (20 keer). Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer.
Juiste cel nummers zijn gezaaid op basis van de verdubbelingstijd van de cellijn (ongeveer 20 uur voor de menselijke FEP-1811 keratinocyten). Het doel is ~ 90% confluentie (~ 10 6 cellen per fles) te bereiken, op de dag van het experiment.
Een experiment dat bestaat uit 12 flessen is optimaal voor een enkele Monogene assay (zes bestraald controle en zes bestraald kolven) die kan worden voltooid in ongeveer vier uur.
2. Behandeling en Bestraling
- Behandel cellen voor een passende tijd met een relevante straling-modificerende verbinding en bloot cellen aan ioniserende straling of γ-straling of röntgenstraling.
Typisch zes flessen dienen als beplating efficiëntie (onbehandeld) en drugs alleen controles. De andere zes flessen worden bestraald.
In dit voorbeeld humane keratinocyten worden behandeld met verschillende concentraties van Cinnulin PF (CPF; Integriteit Nutraceuticals International, Spring Hill, TN, VS; representatieve gegevens voor 20 ug / ml is hieronder weergegeven), een water-oplosbare natuurlijke antioxidant formule, gedurende 1 uur bij 37 ° C. Cellen worden bestraald met 4 Gy met behulp van een 137 Cs bron (Gammacell 1000 Elite bestraler, Nordion International, ON, Canada; 1,6 Gy / min).
3. Plating
- Na de behandeling, zijn enkele celsuspensies verkregen zoals eerder beschreven.
- Het aantal cellen in elk monster worden geteld zorgvuldig met behulp van een hemocytometer en verwaterde zodanig dat juiste cel nummers zijn geënt in petrischalen (vijf herhalingen van elke in 15 mm gerechten).
De beplating efficiëntie en / of overblijvende fractie moet rekening worden gehouden bij het bepalen van het aantal cellen om zaad per plaat. Het doel is te komen tot een bereik van tussen 20 - 150 kolonies.
Petrischaaltjes zijn gerangschikt in een vochtige plastic klonen box en geïncubeerd in een 5% CO 2-omgeving bij 37 ° C voor de kolonie de vorming.
De incubatietijd voor de kolonie de vorming varieert van 1-3 weken voor verschillende cellijnen, het is aanvaard dat de tijd moet gelijkwaardig zijn aan ten minste zes celdelingen. In dit voorbeeld is de controle gerechten voor humane keratinocyten nodig acht dagen tot voldoende grote klonen bestaande uit 50 of meer cellen vormen.
4. Bevestigings-en kleuring Koloniën
Voer de volgende stappen in een zuurkast.
- Verwijder de media uit elk van de platen door aspiratie.
- Was elk bord met 5 ml 0.9% zoutoplossing.
- Bevestig de kolonies met 5 ml 10% neutraal gebufferde formaline oplossing voor 15-30 minuten.
- Vlek met 5 ml 0,01% (w / v) kristalviolet in dH 2 O voor 30-60 minuten.
- Was de overtollige kristalviolet met dH 2 O en laat gerechten drogen.
5. Kolonie tellen
Stereomicroscoop
- Kolonies met meer dan 50 individuele cellen worden geteld met behulp van een stereomicroscoop.
Digitale beeldvorming en het tellen met behulp van imaging-software
- Digitale beelden van de kolonies worden verkregen met behulp van een camera of scanner
- Kolonies worden geteld met behulp van imaging-analyse software pakketten zoals hieronder beschreven.
Cel tellen met behulp van ImageJ (Fiji versie 1.44a)
- Open het afbeeldingsbestand in Fiji, ga naar File -> Open.
- Indien nodig zet de afbeelding om 8-bits-formaat, ga naar Afbeelding -> Aanpassingen ...-> Drempel.
- Pas de drempel tot het niveau van de niet-specifieke achtergrond te verminderen, zodat alleen de kolonies worden gedetecteerd.
- Tellen kolonies met behulp van de volgende: ga naar Process -> Binary -> Zoek maxima.
Voor dit beeldformaat, kan geluid tolerantie op 0 gezet worden. Zorg ervoor dat de lichte achtergrond optie is aangevinkt eneen voorbeeld van de gedetecteerde maxima om te controleren of alle celkolonies correct zijn geregistreerd.