Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

Summary

In dit protocol, genexpressie in gist ( Saccharomyces cerevisiae) Wordt gewijzigd na blootstelling aan oxidatieve stress veroorzaakt door de toevoeging van waterstofperoxide (H ₂ O ₂), Een oxidatiemiddel.

Abstract

In dit protocol is genexpressie in gist (Saccharomyces cerevisiae) veranderde na de blootstelling aan oxidatieve stress veroorzaakt door de toevoeging van waterstofperoxide (H ₂ O _2), een oxidatiemiddel. In het experiment, is gist gekweekt voor 48 uur in 1/2X YPD bouillon met 3X glucose. De cultuur is verdeeld in een controle en behandelde groep. Het experiment cultuur is behandeld met 0,5 mm H ₂ O ₂ in Hanks gebufferde fysiologische zoutoplossing (HBSS) gedurende 1 uur. De controle cultuur is behandeld met HBSS alleen. Totaal RNA wordt gewonnen uit beide culturen en wordt omgezet in een biotine-gelabeld cRNA product door middel van een complex proces. Het uiteindelijke synthese product wordt teruggenomen naar de UVM Microarray Core Facility en gehybridiseerd met de Affymetrix gist GeneChips. De resulterende genexpressie gegevens worden geüpload naar bio-informatica data-analyse software.

Protocol

1. Isoleren van Totaal RNA uit Saccharomyces cerevisiae Met behulp van Enzymatische Lysis

1. Bereid een RNase-vrije werkzone met behulp van RNase ZAP (Ambion).
2. Bereid te werken lyticase reagens door het toevoegen van 1 ml RNase-vrij water direct naar de lyticase flacon om een ​​definitieve werkende oplossing van 10 U / ul te maken. Vortex goed en keer een paar keer om volledige menging te verzekeren. Deze 10 eenheden / ul-oplossing is stabiel gedurende 12 uur.
3. Bereid verse DNase I-oplossing met behulp van de Qiagen DNase kit en op te slaan op het ijs.
4. Label een 1,7 ml microcentrifugebuis met uw identificatie informatie. Overdracht 1,5 ml van de juiste gist cultuur in de buis.
5. Centrifugeer de buis bij 5000 xg (ongeveer 3 / 4 vol snelheid) gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het supernatans (zonder te verstoren pellet) met behulp van een micropipet Verwijder de bovenstaande vloeistof.**** Herhaal stap 4 indien korrelgrootte te klein is of indien aangegeven door instructeur .****
6. Voeg ui 1000 DEPC water om de korrel, vortex, en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 2 minuten. Giet het supernatans af. Verwijder zoveel mogelijk van de vloeistof als mogelijk van de gist pellet.
7. Voeg de volgende aan de gist pellet en vortex te mengen.
   
8. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
9. Zwenk de buis elke 10 minuten naar spheroplasts te genereren. Spheroplasts moet voorzichtig worden omgegaan. Onderzoek gist onder de microscoop te voltooien spheroplasting observeren. Terwijl onderzoek van de gist op de microscoopglaasje, voeg een kleine hoeveelheid van 0,1% SDS op de gist veroorzaakt te zwellen en vormen een perfecte bollen (zelfs voor beginnende cellen). Dit geeft aan dat de celwanden zijn verteerd.
10. Voeg 350 ul b-RLT buffer aan de buis en vortex Krachtig Voor 1 minuut. Zorg ervoor dat uw buis wordt goed afgesloten door houden van de deksel gesloten, terwijl vortexen. Deze procedure zal lyseren de spheroplasts.
11. Voeg 250 ul 100% ethanol aan de buis en kort vortex. Een neerslag kan ontstaan ​​na de toevoeging van ethanol, maar dit heeft geen invloed op de collectie van RNA.
Het verzamelen van de RNA: Label een RNeasy draaien kolom met uw identificatie informationand zorgvuldig overdracht van al de oplossing van stap 10 naar de spin kolom met behulp van een micropipet. Wees voorzichtig dat u de silica membraan contact met de pipet tip. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid. Het RNA in de steekproef zal houden aan de silica membraan van de spin kolom.
12. Verwijder de spin kolom uit de collectie buis. Pipet de pas door de vloeistof (de vloeistof in de collectie tube) terug op de spin kolom en centrifuge opnieuw. Gooi de collectie buis (met de stroom door de vloeistof) en plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis.
13. Voeg 350 ul RW1 buffer om de spin kolom. Deze oplossing wordt gebruikt om de RNA-wassen en zouten en opgeloste cellulaire puin te verwijderen. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid.
Het verteren van het DNA: Verwijder de spin kolom uit de centrifuge, opent de buis deksel en voeg 80 ul van DNase I oplossing voor het midden van de spin kolom membraan. Deze stap zal verteren elke gDNA in het monster. Sluit het deksel kolom en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
14. Transfer de spin kolom naar een nieuwe 2 ml collectie buis.
Reinigen en wassen van de RNA: Voeg 350 ul RW1 buffer om de spin kolom en centrifugeer op volle snelheid gedurende 15 seconden.
15. Gooi de collectie buis en plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis.
16. Voeg 500 ul RPE buffer om de spin kolom om de RNA op het silica membraan te wassen. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid.
17. Gooi de collectie buis en plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis.
18. Nogmaals Was de silica membraan door het toevoegen van een andere 500 ul RPE buffer om de spin kolom. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid.
19. Plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis en centrifugeer in een microcentrifuge op volle snelheid gedurende 1 minuut om ervoor te zorgen eventueel resterende vloeistof is verwijderd uit het silica membraan.
Herstel van de RNA: Breng de RNeasy draaien kolom naar een nieuwe 1,7 ml microcentrifugebuis dat is gelabeld met uw monster informatie. Merk op dat de dop van de nieuwe buis zal open zijn gelaten voor de volgende paar stappen.
20. Voorzichtig pipet 30 ul RNase-vrij water Direct op het centrum Van de silica membraan. Doe het silica membraan niet aanraken met de pipet tip (zie diagram). Kijk goed als u deze stap uitvoert. Gebruik beide handen om de pipet gids. Zorg ervoor dat het water wordt gelijkmatig verdeeld over de membraan.
21. Incubeer de spin kolom bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Centrifugeer op volle snelheid gedurende 30 seconden.
22. Voorzichtig overdracht van de 30 ul die wordt teruggewonnen terug in de 1,7 ml tube op het midden van het silica membraan van dezelfde spin kolom als in stap 22 hierboven. Plaats de kolom in dezelfde 1,7 ml verzamelbuis en incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 1 minuut op volle snelheid. Deze dubbele elutie verzekert dat de maximale hoeveelheid RNA wordt teruggewonnen uit het membraan.
23. Label twee nieuwe 1,7 ml microcentrifugebuizen met uw identificatie informatie en de overdracht van al de herstelde RNA monster tot een van deze buisjes.
24. Transfer 4 ui van dit monster naar de andere gemerkte buis. Dit monster zal terug worden vervoerd naar UVM voor Nanodrop kwantificering en RNA kwalitatieve beoordeling (Dit is om te valideren RNA kwantitatieve en kwalitatieve analyse uitgevoerd op locatie bij de deelnemende instelling).
25. Plaats alle monsters op het ijs.
RNA Kwantificering: Met behulp van de Eppendorf Biophotometer, de absorptie van het RNA-monster te meten op de spectrofotometer bij een 1 tot 50 verdund (1μl monster + 49μl H ₂ O).
26. Evalueer de RNA-kwaliteit met behulp van de E-Gel (Invitrogen) 1,2% prefab agarosegel voor elektroforese.
RNA Kwalitatieve Analyse: Stel de E-gelelektroforese apparaat. Pre-run de gel gedurende 2 minuten volgens de fabrikant procedure. Na de pre-run, verwijdert u de gel kam en voeg 14 ul van het water aan elk putje, gevolgd door 1μl van elk monster aan elk putje. Meng goed door en neer te pipetteren. Gebruik een passende omvang DNA Ladder in een goed voor maat vergelijking later (Bioline Gemakkelijk Ladder ik een standaardmaat of Novagen PCR marker). Record dat monster in elke baan. Laat de gel gedurende 20 minuten.
27. Maak een foto van de gel.

2. Eerste streng cDNA synthese

1. Label een 0,5 ml PCR tube met uw identificatie informatie. Van de concentratie van RNA bepaald uit het bovenstaande experiment, berekent het volume van het monster op 3,0 ug te verkrijgen. Overdragen dit bedrag aan de buis. Voeg genoeg RNase-vrij water om het volume op 11,0 ul te brengen.
2. Voeg 1,0 ul T7 oligo (dT) ₂₄ Reagens op de buis. Zorg ervoor dat bijzondere aandacht te besteden aan de pipet tip volume tijdens deze stap om ervoor te zorgen dat al het reagens werd overgedragen. Vortex de buis en centrifugeer op volle snelheid gedurende 5 seconden. Plaats de buis in een thermocycler ingesteld op 70 ° C gedurende 10 minuten.
3. Terwijl de 70 ° C incubatie wordt uitgevoerd, de voorbereiding van de eerste streng master mix in een nieuwe buis. Zorg ervoor dat u de volgende reagentia toe te voegen OM, Vortex en centrifugeer op volle snelheid voor de vijf seconden en plaats de buis op het ijs.
   

SGbuffer	10 pi
Lyticasesolution (10u/μl)	30 pl

28. Na de 70 ° C incubatie in stap 2 is voltooid, voeg 8 pi van de eerste streng master mix gemaakt in stap 3 aan de buis en incuberen in een thermocycler bij 42 ° C gedurende 60 minuten. Bij de eerste streng synthese van incubatie is voltooid, plaatst de buis op het ijs. Tijdens deze incubatie, de voorbereiding van de tweede streng master mix.

3. Tweede Strand cDNA synthese

1. Maak de volgende tweede onderdeel master mix in een nieuwe buis. Hou het op het ijs. Vortex en centrifuge alle reagentia voor gebruik. Voeg de reagentia in de aangegeven volgorde.
   

Eerste deel master mix:
FirstStrandBuffer5X	4 pl
0.1MDTT	2 pi
10mMdNTP	1 pi
SuperscriptII	1 pi

Gebruik een P2 micropipet om volumes van 2 pl of minder te meten.
29. Vortex de buis en centrifugeer gedurende 5 seconden op volle snelheid.
30. Wanneer de 42 ° C incubatie is voltooid, overdracht alle 130 ul van de tweede streng master mix op de monsterbuis met het RNA en de eerste streng reagentia. Vortex en centrifugeer gedurende 5 seconden bij kamertemperatuur. Incubeer de buis gedurende 2 uur bij 16 ° C in een thermocycler.
31. Op het einde van de 2 uur incubatie en terwijl het monster is nog steeds op 16 ° C, 2μl T4 DNA-polymerase reagens toe te voegen aan de buis. Kort vortex en de buis en incubeer bij 16 ° C centrifuge voor niet meer dan 5 extra minuten. Incuberen langer dan 5 minuten kan de kwaliteit van de cDNA als gevolg van de 3'to 5'exonuclease activiteit van de T4-polymerase.
32. Aan het eind van de 5 minuten incubatie, voeg 10 ul 0,5 M EDTA aan de T4 DNA-polymerase reactie te stoppen. Bewaar de tube bij -20 ° C.

4. Precipiterend de cDNA

1. Centrifuge een Phase Lock Gel tube op volle snelheid een minuut om te verzekeren de gel wordt op de bodem van de buis. NIET VORTEX FASE TUBES LOCK.
2. Voeg 162 ul van de Onderste laag Uit de pH 8.0-Tris gebufferde Fenol / Chloroform / isoamylalcohol (PCI), om de inhoud van de tweede streng cDNA-synthese reactie buis en vortex gedurende 5 seconden ingedrukt om de inhoud (De totale omvang van de cDNA-synthese stap uit het bovenstaande experiment mix is 162 ul. De PCI-stap vereist gelijke volumes van waterige en organische mengsels).
3. Breng alle van de cDNA-PCI-mengsel aan de fase slot gel buis met behulp van een micropipet. NIET VORTEX De fase slot gel buis.
4. Centrifugeer op volle snelheid gedurende 2 minuten.
5. Label een nieuwe 1,7 ml microcentrifugebuis. Gebruik een micropipet om de bovenste laag overgang van de fase sluis gel tube naar de nieuw label 1.7 ml buis. Probeer zoveel mogelijk van de laag als mogelijk te verzamelen.
6. Voeg de volgende om de 1,7 ml microcentrifugebuis en vortex.
   

Tweede deel master mix
DEPC Water	91 ul
5X Tweede Strand Buffer	30 ul
DNTPs (10mm)	3 ul
	Een ul
	4 ul
	Een ul

33. Plaats de buis in de centrifuge met het scharnier van de buis naar buiten gericht en centrifugeer op volle snelheid gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
34. Verwijder de buis uit de centrifuge en let niet op de cDNA pellet te verstoren. De pellet moet roze en ongeveer de grootte van een korrel zout en aan de kant van de buis onder het scharnier. Plaats op ijs en onmiddellijk overgaan naar de volgende stap.

5. Reiniging van de cDNA Pellet

1. Met behulp van een P1000 micropipet, verwijder zorgvuldig al het supernatant van de buis. Wees voorzichtig dat u de pellet te verstoren. Vergeet niet dat de pellet is je voorbeeld!
2. Voeg 500μl koude 80% ethanol (opgeslagen tot -20 ^° C diepvriezer) op de buis. Voorzichtig dop de tube en omgekeerd het langzaam een ​​paar keer. Let op je pellet op de voet. Als de pellet losraakt, terug te plaatsen van de buis in rek en laat de pellet op de bodem. Als alternatief kunt u de buis centrifuge op volle snelheid gedurende 15 seconden om de pellet terug naar de bodem van de buis.
3. Met behulp van een P1000 micropipet, verwijder voorzichtig de ethanol zeer voorzichtig om de pellet te verstoren. Tip de buis om de verwijdering van zoveel mogelijk vloeistof mogelijk te maken.
4. Herhaal stap 2 en 3 met een nieuwe portie van 80% ethanol.
5. Ten slotte verwijdert u al het ethanol mogelijk door middel van een P1000 micropipet. Centrifugeer de buis op volle snelheid voor 5 seconden en het gebruik van een P20 micropipet, verwijder dan de laatste paar microliter van ethanol. Het doel is om zoveel ethanol als mogelijk te verwijderen zonder de pellet te verstoren.
6. Plaats de open buis in een rek of drogen box voor 10-20 minuten om de resterende ethanol verdampen. De gedroogde pellet is gemakkelijk verloren zodra het droog is. WEES VOORZICHTIG om de buis voorzichtig te behandelen. Wanneer u klaar bent, sluit de dop. Visualiseer de gedroogde pellet om te bevestigen dat aanwezig is in de buis.
7. Resuspendeer de pellet in 22 ul van RNase-vrij water en plaats de buis op het ijs.

6. InVitroTranscription (IVT)

1. De ENZO bioarray kit bevat alle reagentia die nodig zijn om biotine gelabelde cRNA bereiden van cDNA.
   Een meester mixfor de hele klas wordt voorbereid als follows.The instructeur bereidt deze mix of wijst iemand uit de klas. Dit moet gebeuren in een RNase-vrij gebied.
   

Ethanol (100%)	405 ul
NH 4 OAc	80 ul
Pellet Paint	Een ul

LET OP:
35. Label een 0,5 ml PCR-buis. Combineer het volgende in de buis en pipet op en neer meerdere malen om te mengen. Spin in een centrifuge op volle snelheid gedurende 5 seconden ingedrukt om alle reagentia tot op de bodem van de buis.
    

	Amt / monster	# Samples	Totaal
Reagens 1 [10x Reactie buffer]	4μl
Reagens 2 [10x Biotinnucleotides]	4μl
Reagens 3 [10x DTT]	4μl
Reagens 4 [10x RNase Inhibitor]	4μl
Reagens 5 [20x T7 RNA-polymerase]	2μl
Totaal Volume	18 ul

Bereid voldoende master mix voor het aantal monsters plus een. Dit zal voldoende te verzekeren voor pipetteren doeleinden.
36. Incubeer de buis bij 37 ° C for16 uur in de thermocycler. Wanneer de reactie is voltooid, bewaren van het monster bij -20 ° C

7. Reiniging van de Gebiotinyleerd cRNA

1. Breng de hele cRNA monster op een nieuw 1,7 ml microcentrifugebuis. Voeg 60 ul van RNase-vrij water en 350 ul RLT buffer en vortex gedurende 5 seconden.
2. Nogmaals Voeg 250 ul 100% ethanol en vortex.
3. Label een RNeasy spin-kolom en breng de hele cRNA monster op de kolom. Pas op dat u het uiteinde van de pipet touch aan het silica membraan. Sluit het deksel en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid.
4. Verwijder de spin kolom uit de collectie buis. Pipet de pas door de vloeistof (de vloeistof in de collectie tube) terug op de spin kolom en centrifugeer opnieuw gedurende 15 seconden.
5. Plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis en pipet 500 pi van RPE buffer op de spin kolom. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 15 seconden op volle snelheid. Gooi collectie buis en de pas door de vloeistof. Plaats de spin kolom in een nieuw 2 ml collectie buis.
6. Voeg nog eens 500 ul RPE buffer om de spin kolom.
7. Transfer de spin kolom in een nieuwe collectie buis en het uitvoeren van een kolom "drogen" draaien op volle snelheid gedurende 2 minuten.
8. Label een nieuwe 1,7 ml microcentrifugebuis met uw identificatie informatie. Overdracht van de spin kolom van deze buis.
9. Pipetteer 30 ul RNase-vrij water op het midden RNeasy silica membraan en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Sluit de buis en centrifugeer gedurende 1 minuut op volle snelheid.
10. Voorzichtig overdracht van de 30 ul die wordt teruggewonnen terug in de 1,7 ml tube op het midden van de RNeasy silica membraan van dezelfde spin kolom. Plaats de kolom in om dezelfde 1,7 ml verzamelbuis en incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 1 minuut op volle snelheid. Deze dubbele elutie verzekert dat de maximale hoeveelheid cRNA wordt teruggewonnen uit het membraan.
11. Deze schone biotine-gelabeld cRNA adequaat Transfer naar een nieuwe 1,7 ml centrifugebuis label.
12. Bepaal de cRNA concentratie volgens dezelfde procedure als hierboven beschreven tijdens de RNA-isolatie procedure. Noteer de concentratie en 260/280 ratio.

8. Fragmentatie van de cRNA voor Target Voorbereiding

1. Label een 0,5 ml PCR tube met uw identificatie informatie. Overdracht 5 ug van het equivalente hoeveelheid cRNA aan de buis. Voeg genoeg RNase-vrij water om het totale volume tot 16,0 ul te brengen, en daarna 4,0 ul van 5x fragmentatie buffer toe te voegen aan de buis. Het totale volume in de buis moet 20,0 ul worden.
2. Vortex de buis en centrifugeer gedurende 10 seconden. Incubeer de buis bij 94 ° C gedurende 30 minuten in een thermocycler. Leg op het ijs na de incubatie.

9. Het beoordelen van de fragmentatie en een gefragmenteerde cRNA met behulp van agarose gel

1. Stel de E-gelelektroforese apparaat met behulp van een 1,2% agarosegel prefab. Pre-run de gel gedurende 2 minuten volgens de fabricage van de aanbeveling
2. Voeg 14 ul van het water aan elk putje op de E-gel.
3. Voeg 2μl van elk monster aan elk putje en pipet op en neer om goed te mengen. Analyseer zowel de versnipperde en gefragmenteerde cRNA van elk monster. Het is het beste om de monsters (versnipperde en gefragmenteerde) belasting in het naburige rijstroken. Noteer de identiteit van elk monster in elke baan.
4. Voeg 4 pi van een DNA-ladder (Bioline Gemakkelijk Ladder ik een standaardmaat of Novagen PCR marker) om een ​​baan van de gel
5. Run de gel gedurende 20 minuten.
6. Visualiseer de E-gel op een transilluminator. Maak een gel beeld.

10. Hybridisatie aan de Gist 2,0 GeneChip

Representatieve resultaten:

Figuur 1. Een gescande Affymetrix Gist GeneChip Image (Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS))

Figuur 2. 2D-spreidingsdiagram van alle genetische transcripts (~ 6700 genen), vergelijking van een controle en behandelde gist data. Elk punt staat voor een enkel gen. Genen gekleurd in paars geven aan genen die differentieel uitgedrukt, terwijl genen gekleurd in het rood zijn dat niet. Beschrijvingen voor het differentieel tot expressie genen zijn geëtiketteerd in de bijbehorende legenda en de meeste zijn betrokken bij de controle van de celcyclus in dit voorbeeld. (Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS))

Figuur 3. Dit stroomschema illustreert differentieel tot expressie genen in een getroffen biologisch proces. De genen aangegeven met een rode ster geeft de down-gereguleerde genen in de meiotische pad. (De database voor Annotation, visualisatie en geïntegreerde Discovery (DAVID)

Figuur 4. Representatieve resultaten van een vulkaan Plot. Controle en behandelde monsters werden vergeleken met een p-waarde cut off van 0,05 en een 1,5 maal uitdrukking veranderen afgesneden. Dit perceel is gegenereerd met behulp van Geospiza's Genesifter software gedoneerd aan de studenten voor educatieve doeleinden.

CDNA mengsel	22μl
Enzomastermix [fromabove]	18μl
TotalVolume	40μl

Discussion

Toepassingen en betekenis.

The Vermont genetica Network outreach-programma, aan de Universiteit van Vermont, voert undergraduate outreach tot acht partner baccalaureaat universiteiten in heel de staat. Het doel van de VGN Outreach Core is om studenten bloot te leggen in de staat Vermont om state-of-the-art wetenschappelijke technologie en bronnen met behulp van hands-on ervaringen. De beschreven microarray-module is ontwikkeld in 2003 en latere. Het is aangeboden als een mini-cursus of geïntegreerd in het bestaande curriculum laboratorium aan de deelnemende instellingen.

Dit project, tussen de universiteit kernen en undergraduate colleges, bevordert de samenwerking in onderwijs en onderzoek. Microarray outreach in de staat heeft verbeterd curriculum en creëerde onderzoeks-en netwerkmogelijkheden voor kernfaciliteiten, docenten en studenten.

Als undergraduate faculteit goedkeuring van het programma worden zij aangemoedigd om uniek experiment ontwerp, mits er geschikt Affymetrix GeneChips en annotatie beschikbaar. Alle informatie voor deze module inclusief het laboratorium handleiding, referenties en PowerPoint-presentaties zijn online beschikbaar (Vermont Genetica Network, 2008).

Kritische stappen:

Spheroplasting: Het is belangrijk om een ​​succesvolle spheroplasting waarnemen onder de microscoop. Het gebruik van SDS is zeer nuttig zijn, omdat zorgt ervoor dat de gist zwelling wat resulteert in sferoïden. Het is belangrijk te constateren dat de ontluikende cellen sferoïden vorm ook. Als gedeeltelijke spheroplasting wordt waargenomen, wordt een langdurige behandeling met lyticase aanbevolen.

Pellet reiniging: Tijdens de neerslag en de daaropvolgende reactie van ethanol wasstap, is het heel gemakkelijk om te verliezen van de cDNA pellet. Uiterste zorg en nauwgezette aandacht voor de pellet is noodzakelijk.

Toepassing van de water naar het midden van het membraan: Tijdens de RNA-elutie stap van het membraan, is het belangrijk om "spuiten" het 30 ul van het water rechtstreeks naar het centrum van het silica membraan. Als dit niet bereikt, kan de kolom worden gecentrifugeerd en de daaruit voortvloeiende elutant kan opnieuw worden toegepast op de silica membraan opnieuw. Dit kan worden herhaald zo vaak als nodig is.

Wijzigingen en Product Vervangingen:

1. Alternatieve RNA clean-up kolommen kunnen worden vervangen. Voorbeelden hiervan zijn de USB-prep-gemak en de Invitrogen Pure Link RNA kit, en de Omega RNA clean-up kit om een ​​paar te noemen.
2. Schizosaccharomyces pombe is een optionele gist. De Affymetrix GeneChip bevat zowel genoom op dezelfde chip
3. Diverse behandelingen en tijden kunnen worden gebruikt. Dit kan onder andere medicamenteuze behandelingen, temperatuur behandelingen, anti-oxidanten, etc. De behandeling tijden kunnen ook worden aangepast.
4. DNase behandeling kan niet worden verplicht, omdat de beschreven methoden gebruiken het gebruik van een oligo (dT) primer.
5. Het is niet verplicht om een ​​dubbele elutie van het RNA uit de kolom met dezelfde 30 ul aliquot uit te voeren. Once is bijna altijd voldoende. Dit wordt voorgesteld om te verzekeren dat een volledig herstel wordt verkregen. Bovendien, het water wordt gebruikt om de RNA-elueren uit de kolom kan voorverwarmd worden tot 65 ° C tot verdere versterking van de capaciteit om RNA te herstellen van de silica kolom.
6. Veel methoden zijn beschikbaar om RNA te kwantificeren. De Eppendorf-en Nanodrop zijn alleen geselecteerd op hun gebruiksgemak en geteste nauwkeurigheid.
7. Agarosegelelektroforese veel worden uitgevoerd met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. De E-Gel is niet verplicht, maar is wenselijk omdat het RNase gratis en vereist geen gel stollen wachttijd.
8. Bestellen informatie voor producten is geleverd. Echter, vele algemene reagentia te bestellen van meerdere leveranciers.
9. Een Cycle cDNA reagentia kan afzonderlijk worden aangeschaft, indien dat meer is kosteneffectief.
10. Er zijn andere doelgroepen prep methoden, maar wij vinden dit een biedt meer onderwijs kansen voor de student.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spetrophotometer
Thermocyler
Reactievaatjes
Vortex
Roer Platen (2)
P-10s pipetten
P-20's pipetten:
P-200's pipetten:
P-1000's pipetten:
Camera en transilluminator
E-Gel Apparatuur Invitrogen G6000-08
E-Gels Invitrogen G6018-02
Axygen 1,7 ml. Duidelijk Krackler 383-MCT175C
Axygen 0,5 ml helder buizen Krackler 383-MCT060C
Axygen 2ml vast te leggen buizen Krackler 383-MCT200NC
Dozen van P-10 ART tips: CLP BT10XL
Dozen van P-100 ART tips: CLP BT200
Dozen van P-20 ART Tips: CLP BT20
Dozen van P-1000 ART Tips: CLP BT1000
Gist Chips
25 ml steriele disposable pipetten-
5 ml steriele disposable pipetten-
Microfugebuisje racks
KimWipes:
Lab Coats
Roer Bars
Cultuur kolven
Innoculating loops
Sharpies
Handschoenen
Autoclaaf tape
Roerwerk bars
30% waterstofperoxide EMD Millipore 386.790
HBSS zonder Ca, Mg, of kleurstof Sigma-Aldrich H6648-100ml
Qiagen RNeasy Mini Kit: Qiagen 74104
Qiagen DNase Kit: Qiagen 79254
RNase Remover Denville Wetenschappelijk D1180
Harleco Alcohol 100% EMD Millipore 65347
ENZO IVT Kit ENZO ENZ-42655-10
Lyticase: een fles VWR IC19012310
Water, Cell Culture kwaliteit EMD Millipore 4,86505
Gist cultuur: ATCC 18824
YPD bouillon poeder EMD Millipore 4.8504
D (+) Glucose, watervrij EMD Millipore 346.351
Sorbitol EMD Millipore 56755
EDTA EMD Millipore 4005
SDS-oplossing, 20% EMD Millipore 7990-OP
Pellet Paint EMD Millipore 69049
PCI RNase DNase vrij (7 porties): Fisher AC32711-500
7,5 m NH4OAc Fisher ICN1987 5980
Fragmentatie buffer (200 mM Tris-acetaat, pH 8,1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)
Trizma Base Fiaher 50-899-90034
KOAc Fisher NC9757725
MgOA Fisher NC9681042
Laden met Dye Invitrogen 10482055
PCR Markers EMD Millipore 69278-3
Phase Lock Gels Fisher FP2302820
Een-Cycle cDNA Kit Invitrogen A10752-030
Inclusief;
E. coli DNA Pol
DNTP's
T4 DNA Pol.
T-7 oligod (T)
0,5 ml EDTA pH 8,0
Eerste Strand Buffer
E. Coli RNaseH
Tweede Strand Buffer
E. Coli-DNA-ligase
SuperScript II
DTT