Verwerping van Fluorescentie Achtergrond in Resonance en spontane Raman Microspectroscopie

Samenvatting

We bespreken de bouw en exploitatie van een complex niet-lineaire optische systeem dat ultrasnelle all-optisch schakelen gebruikt om te isoleren Raman van fluorescentie-signalen. Met behulp van dit systeem zijn wij in staat om succesvol scheiden Raman en fluorescentie-signalen gebruik te maken van puls energie en de gemiddelde krachten die blijven biologisch veilig.

Samenvatting

Raman spectroscopie wordt vaak geplaagd door een sterke fluorescerende achtergrond, in het bijzonder voor biologische monsters. Als een monster wordt opgewekt met een trein van ultrasnelle pulsen, een systeem dat tijdelijk kan spectraal aparte overlappende signalen op een picoseconde tijdschaal kan isoleren tijdig aankomen Raman verstrooide licht van de late aankomst fluorescentie licht. Hier bespreken we de bouw en exploitatie van een complex niet-lineaire optische systeem dat alle-optisch schakelen gebruikt in de vorm van een low-power optische Kerr gate te isoleren Raman en fluorescentie-signalen. Een enkele 808 nm laser met 2,4 W van de gemiddelde vermogen en 80 MHz herhalingsfrequentie is gesplitst, met ongeveer 200 mW van 808 nm licht wordt omgezet tot <5 mW van 404 nm licht naar het monster te Raman verstrooiing te wekken. De resterende onbekeerde 808 nm licht wordt vervolgens verstuurd naar een niet-lineaire medium waar het fungeert als de pomp voor de all-optische sluiter. De sluiter opent en sluit in 800 fs met een maximale efficiëntie van ongeveer 5%. Met behulp van dit systeem zijn wij in staat om succesvol Raman en fluorescentie-signalen gescheiden op een 80 MHz herhalingsfrequentie met behulp van pulse energieën en krachten die de gemiddelde blijven biologisch veilig. Omdat het systeem geen extra capaciteit in termen van optische macht heeft, hebben we een aantal detail ontwerpen en de afstemming overwegingen die helpen bij het maximaliseren van de productiviteit van het systeem. We bespreken ook ons ​​protocol voor het verkrijgen van de ruimtelijke en temporele overlap van het signaal en de pomp balken in het Kerr medium, evenals een gedetailleerd protocol voor de spectrale acquisitie. Tot slot melden wij een enkele representatieve resultaten van Raman-spectra verkregen in de aanwezigheid van sterke fluorescentie met behulp van onze tijd-gating systeem.

Protocol

1. Enige zorg moeten worden genomen in de voorbereiding en het plaatsen van een Raman monster in dit systeem.

1. Omdat het systeem meestal maakt gebruik van een zeer hoge numerieke apertuur doelstellingen met zeer korte werkafstanden worden de monsters die op een dekglaasje aan. Biologische monsters zijn meestal geplaatst op een nummer een dikte van dekglaasje gemonteerd in een Attofluor cel kamer (Invitrogen, Carlsbad, CA).
2. Vloeibare monsters, met name die giftig voor de mens, worden geplaatst in een kleine glazen fles met een dekglaasje cement bevestigd aan de opening door middel van een siliconen epoxy. De fles wordt dan omgekeerd voor de meting.
3. Omdat ons systeem hangt af van precieze timing van de pomp en signaal pulsen, zijn we gedwongen niet met de conventionele richten aanpassing van onze microscoop, die de doelstelling vertaalt omhoog en omlaag te gebruiken. Dit voegt en trekt optische pad uit ons systeem. In plaats daarvan, plaatsen we onze monsters op een tweede podium geplaatst op de top van de microscoop podium dat zijn eigen onafhankelijke focus controle heeft.

2. Om tijd-gated Raman spectra te nemen, moet de excitatie bundel goed worden voorbereid.

1. We beginnen met het licht die uit een 2,4 W afstembare gepulseerde Ti: Sapph laser (Chameleon, Coherent Systems, Santa Clara, CA). Elke puls in de 80 MHz puls trein heeft 30 nj van energie, heeft een tijdelijke breedte van 140 fs, en heeft een spectrum gecentreerd op 808 nm met een spectrale bandbreedte van ~ 6 nm.
2. Om te voorkomen dat back-reflecties van het opnieuw invoeren van de laser holte, wordt het licht doorgegeven door middel van een Faraday isolator. Een half-wave plaat geplaatst voor de Faraday isolator maakt continue afstemming van het totale vermogen gestuurd in het systeem.
3. Omdat 6 nm is te breed een bandbreedte voor de meeste Raman modes op te lossen, wordt de straal verzonden via een zeer smalle (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) bandfilter gecentreerd op 808 nm.
4. Het licht is dan gericht door een achromatische doublet (f = 100 mm) op een 5 mm β-bariumboraat (BBO) kristal (CASIX, Fuzhou, Fujian, PR China) om de golflengte van 808 nm tot 404 nm te halveren. De BBO kristal is geplaatst in een berg met een punt en tilt controles, en ook gemonteerd op een vertaling podium. Het maximaliseren van de efficiëntie van de golflengte conversie, moet het kristal geplaatst worden precies symmetrisch over de focus van de doublet, en met zijn kristallen as afgestemd op de polarisatie van de inkomende bundel.
5. Vanwege de efficiëntie van de golflengte conversie is polarisatie-afhankelijk is, kan de controle over de hoeveelheid licht aan het monster worden verkregen door het plaatsen van een seconde half-wave plaat na de Faraday isolator. Door het roteren van deze waveplate, kan de intensiteit van het licht naar het monster onafhankelijk van de intensiteit gestuurd in de pomp bundel (hierna te bespreken) worden aangepast.
6. De golflengte-geconverteerde licht recollimated door een tweede achromatische doublet (f = 500 mm) zodanig gekozen, dat de uittredende bundel is groot genoeg om de achterkant opening van de microscoop objectief te vullen, en gericht in een omgekeerde microscoop (IX-71, Olympus, Center Valley, PA) door middel van twee spiegels.
7. De microscoop doel, zijnde het optische element ondergebracht in de meest monolithische component van het systeem, definieert de optische as. Voor het uitlijnen van de excitatie-balk om deze as, is een spiegel geplaatst in het monster vlak van de microscoop. De twee spiegels worden vervolgens iteratief afgestemd met inachtneming van de back-gereflecteerd laserstraal op een CCD cam-tijdperk (μEye, IDS, Obersulm, Duitsland) verbonden aan de beeldvorming poort van de microscoop. Ervan uitgaande dat het beeld op de camera is gericht op de microscoop field-of-view, de straal is on-axis als het brandpunt is gecentreerd op de microscoop chip en de vertaling van het doel langs de z-as verandert niets aan het middelpunt van de onscherpe bundel.
8. Wanneer een monster wordt geplaatst in de steekproef vliegtuig en bestraald met laserlicht Raman scattering plaatsvindt. Een dichroïsche filter geplaatst onder de microscoop doel scheidt de golflengte verschoven Raman diffuus licht (en fluorescentie) van de excitatie balk, de leiding van de Raman verstrooid licht naar de zijkant poort van de microscoop. De microscoop werd aangepast aan de lenzen in dit pad, zodanig dat het signaal licht uit gecollimeerd de microscoop te verwijderen.
9. Omdat het signaal straal die uit de microscoop is duidelijk groter is dan de opening van de Glan-Thompson polarisatoren, een 0.47x telescoop opgebouwd uit twee achromatische doubletten (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) wordt gebruikt om de bundel krimpen.
10. Het signaal licht wordt dan gepolariseerd door een Glan-Thompson polarisator gericht op 0 ° ten opzichte van de verticale in het lab frame, en gericht op een dichroïde spiegel waar het wordt gerecombineerd met de pomp balk.

3. Om de optische poort om te werken bij maximale efficiëntie, moet erop worden gelet bij de voorbereiding van de pomp balk (Kerr balk) ook.

De pomp puls wordt eerst versterkt door 0.35x met een telescoop gebouwd met twee achromatische doubletten (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm) om de uiteindelijke grootte van het signaal straal wedstrijd.
1. De pomp bundel wordt vervolgens verstuurd naar een vertraging lijn bestaat uit een rechte hoek prisma geplaatst op een lineaire vertaling fase die kan worden afgestemd op de temporele overlapping van de pomp en signaal peulvruchten (tuning hierna te bespreken) te verzekeren.
2. Na de delay line, wordt de straal verstuurd via een half-wave plaat en polarisator georiënteerd op 45 ° ten opzichte van de verticale in het lab frame. Dit zorgt voor de juiste polarisatie toestand van de pomp bundel wanneer zij tot de niet-lineaire medium.
3. Het licht wordt dan gereflecteerd van twee spiegels, een met piëzo-elektrische controles, die worden gebruikt om fijn de positie van de pomp straal zodanig dat het ruimtelijk overlapt met het signaal balk. De overlap wordt verkregen door het observeren van de pomp en de signaal balken op twee locaties, een dichtbij en een ver van de dichroïsche spiegel waar de balken worden gecombineerd. Door het gebruik van de eerste stuur spiegel om de twee stralen elkaar overlappen op de nabije punt, en de piëzo spiegel om de balken overlap aan het andere punt, kan de pomp balk gemaakt precies collineair met het signaal balk.
4. Met de twee balken gecombineerd, zijn de Kerr poort en systeem voor het verzamelen opgezet om de verzamelde tijd-gated signaal te maximaliseren.

4. Met de twee balken gecombineerd, zijn de Kerr poort en systeem voor het verzamelen opgezet om de verzamelde tijd-gated signaal te maximaliseren.

1. De pomp en signaal balken worden eerst door een dichroïsche filter dat een OD van 6 heeft op 404 nm om eventuele resten van excitatie licht van spannende Raman verstrooiing te voorkomen dat binnen de niet-lineaire medium.
2. De pomp en signaal balken worden dan zowel gericht door een achromatische doublet (f = 35 mm) in een 1 cm weglengte kwarts cuvet met daarin de niet-lineaire materiaal. Elke niet-lineaire materiaal met een voldoende hoge niet-lineaire index (hoger dan CS _2), en voldoende korte tijd respons (<2 ps), kan hier worden gebruikt. Voor deze experimenten maken we gebruik van koolstofdisulfide, CS _2, dat een niet-lineaire index n ₂ = 3,1 x 10 ^-18 m ² / W. heeft Het licht wordt dan recollimated door een tweede doublet met een brandpuntsafstand identiek aan de eerste.
3. De balken worden vervolgens door en de Glan-Thompson analyzer op een draaiende mount, en vervolgens door een set van absorptie en interferentie filters die gecombineerd hebben een buitendiameter van 10 bij 808 nm.
4. Tenslotte wordt het signaal licht gericht door een achromatische doublet (f = 35 mm) in een 50 um multimode glasvezel, waarbij de vezel is gemonteerd in een stadium dat vertaling in het x, y en z. maakt De vezel wordt dan gekoppeld aan een commerciële imaging spectrograaf met aangehechte CCD-camera (SP2300i en Pixis 100B, respectievelijk, beide vervaardigd door Princeton Instruments, Trenton, NJ).
5. Voor het uitlijnen van het systeem voor het verzamelen de verzamelde signaal te maximaliseren, is de analysator ingesteld op 0 ° en een test sample van tolueen wordt geplaatst in het monster vlak. Door het aanpassen van de x, y en z controles van de vezel berg, is de verzamelde Raman-signaal geoptimaliseerd.
6. Om te zorgen voor een goede ruimtelijke en temporele overlap van de pomp en het signaal balken, is een spiegel geplaatst in het monster vlak van de microscoop. De 404 nm filter is uit het systeem verwijderd. Met de analyzer gedraaid tot 90 ° van de retroreflected 404 nm straal wordt gestuurd naar de spectrograaf met de intensiteit zodanig aangepast dat het niet de camera te verzadigen. Met de pomp straal uit, de analyzer is gedraaid om het uitgezonden signaal 404 nm te minimaliseren. Met de pomp straal keerde terug op, is de vertraging fase langzaam afgestemd tot aan de overdracht van het 404 nm licht begint te verhogen. Dan, tuning door iteratief de vertraging fase, de piëzo-elektrische spiegel, en de x, y en z controles van de vezel, een maximaliseert het signaal.
7. Omdat de retro-weerspiegeld 404 nm balk en de Raman verstrooide licht kunnen enigszins verschillende paden te nemen door het systeem, worden de laatste aanpassingen gemaakt door het plaatsen van een sterke Raman verstrooier (zoals tolueen) op het monster het podium en de iets aanpassen van de uitlijning door het veranderen van de vertraging podium, piezeo-elektrische spiegel, en x, y en z controles van de fiber to the Raman-signaal te optimaliseren.

5. Verzameling van een time-gated Raman spectrum vereist overname van een aantal spectra te corrigeren voor het systeem artefacten.

1. Met de analysator ingesteld op 0 °, de excitatie balk op en de pomp straal uit, is een "ungated" spectrum genomen, die het spectrum, dat zou worden overgenomen zonder het voordeel van de time-gating systeem.
2. Met de analysator ingesteld op 90 °, de excitatie-balk en de pomp straal nog steeds af, is een back-ground spectrum genomen, die de hoeveelheid strooilicht lekt door de polarisatoren en andere elementen in het systeem.
3. Met de analyser nog op 90 °en alle balken op de "gated" spectrum is genomen, die de Raman strooilicht toegestaan ​​door de gekruiste polarisatoren door de aanwezigheid van de pomp balk.
4. Tot slot, met de analysator nog steeds op 90 °, de excitatie-bundel uit en de pomp balk op, is een tweede achtergrond spectrum genomen, die de bijdrage aan de "gated" spectrum van de resten van 808 nm licht in de spectrograaf.
5. Daarnaast wordt een spectrum genomen met alle lasers uit, het karakteriseren van de baseline "donkere" signaal niveau van de camera en elektronica.
6. Omdat de spectra vereisen vaak lange integratie tijden, is het noodzakelijk om deze integratie tijd breken in verschillende stukken (frames) om voor een goede correctie van kosmische straling - een veelvoorkomend probleem bij de verwerving van gegevens over overspanningen van enkele minuten.

6. Eenmaal verworven, een aantal processtappen zijn nuttig om de kwaliteit en het uiterlijk van de gegevens te verbeteren.

1. Ten eerste worden alle spectra donkere gecorrigeerd door af te trekken uit de "donkere" spectrum.
2. Om te corrigeren voor kosmische straling, zijn de verschillende frames vormen een overname ten opzichte van elkaar op een pixel-per-pixel basis. Voor elke pixel van een beeld dat valt buiten de twee mediane afwijkingen ten opzichte van de mediaan waarde voor die pixel in alle frames, is dat de pixel de waarde vervangen door de mediaan waarde in alle frames.
3. De kosmische stralen gecorrigeerd frames worden dan gemiddeld en afgevlakt door een Savitzky-Golay filter ^1.
4. Om haalt de "ware" gated spectrum, trekken we de "excitatie-only" en "pomp-only" spectra van de gemeten gated spectrum.
5. Ten slotte is de gated en ungated spectra worden vervolgens de achtergrond gecorrigeerde door vermindering van een 5 ^e-orde polynoom, bepaald volgens de methode van Lieber en Mahadevan-Jansen ^2.

7. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Schematische weergave van het Kerr gating systeem. De pomp lichtbaan wordt weergegeven in het rood, terwijl de SHG pad wordt weergegeven in blauw. Het pad waar Raman en fluorescentie worden overlapt wordt getoond in het groen, terwijl het pad waar de fluorescentie is tijdelijk werd uitgefilterd wordt weergegeven in het geel. Afkortingen als volgt: BPF, band pass filter, CCD, charge-coupled device, DCM, dichroïsche spiegel, FI, Faraday isolator; λ / 2, half wave plate, LPF, lange-pass filter, NLM, niet-lineaire medium; P, polarisator , SHG, tweede harmonische generatie kristal.

Figuur 2 Top:. Raw spectra van cumarine opgelost in immersie olie. Rode curve toont het spectrum genomen met het hek open gehouden (analyzer ingesteld voor maximale transmissie). Zwarte curve geeft het spectrum genomen met de analyzer uitgelijnd voor minimale transmissie en een pomp straal toegepast (de gated spectrum). Blauwe curve toont de spectum genomen met de analyzer uitgelijnd voor minimale transmissie en geen pomp beam toegepast (gate gehouden gesloten). Groene curve toont het spectrum genomen met alleen de pomp straal toegepast. Onderbroken magenta lijnen geven spectrale gebied getoond in paneel hieronder. Alle spectra werden glad gemaakt met een 11 punt, 3e orde Savitzky-Golay filter. Bodem: Spectra van cumarine opgelost in immersie olie na fluorescentie achtergrond aftrekken. Rode curve is het spectrum met het hek open gehouden, en de blauwe curve is de gated spectrum. De gated spectrum toont duidelijk de ingewikkelde high-golfgetal piek kenmerk van oliën.

Discussie

Het gebied van biomedische Raman spectroscopie heeft gezien toenemende belangstelling in de afgelopen jaren als gevolg van de bewezen potentieel voor het oplossen van een aantal moeilijke uitdagingen in de biologische diagnostiek. Bijvoorbeeld, hebben Raman spectra is aangetoond dat diagnostische waarde hebben in de opsporing ^{3, 4, 5, 6.} Raman spectroscopie is ook gebruikt bij bacteriële kwantificatie ^{7, 8} en bacteriële drug reactie ^9. Het heeft ook te vinden toepassing in een breed scal...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Lenzen	Thorlabs	Verschillende	Alle lenzen gecoat om maximale transmissie verliezen van 1% hebben elk
Tunable Ti: Sapph laser	Samenhangend	Kameleon	30 nj, 200 fs, 80 MHz
40X olie-immersie objectief	Olympus	UApo/340	NA = 1,35
Omkeermicroscoop	Olympus	IX-71	Aangepast om alle lenzen in zijpoort te verwijderen
Halve golf plaat	Thorlabs	AHWP05M-600
Glan-Thompson polarisator	Thorlabs	GTH10M	~ 10% signaalverlies
Spectrometer	PI Acton	SP2300i
CCD	PI Acton	Pixis 100B
Mathmatical software	The MathWorks	MATLAB	versie 2008a
Faraday isolator	EOT	BB8-5I
Piëzo-elektrische spiegel	Newport	AG-M100
BBO kristal	CASIX	gewoonte	1 mm dik
Bandpass filter 1	Andover	008FC14	808 ± 0.4 nm
Dichroic spiegel	Semrock	FF662-FDI01	band edge bij 662 nm
Lange-pass filter	Semrock	BLP01-405R	band edge bij 417 nm
Bandpass filter 2	Semrock	FF02-447/60	417 tot 447 nm
CS 2	Sigma-Aldrich	335266	99% zuiverheid
Cumarine 30	Sigma-Aldrich	546127	99% zuiverheid
Immersie olie	Cargille	16242	Type DF