Meten Coördinatie Motor in Muizen

Samenvatting

Protocollen worden aangeboden voor twee gevestigde motorische coördinatie taken, het versnellen rotarod en horizontale balk, ook twee tests ontwikkeld in Oxford onlangs, de statische staven en parallelle staven. Deze tests kunnen detecteren motorische stoornissen potentieel van interesse in hun eigen recht, maar ook als mogelijke variabelen in testen van andere gebieden van gedrag.

Samenvatting

Muizen worden steeds vaker gebruikt in behavioral neuroscience, grotendeels ter vervanging van ratten als de behavioristische's dier naar keuze. Voordat aspecten van gedrag, zoals emotionaliteit of cognitie kan worden beoordeeld, is het echter van vitaal belang om te bepalen of de motorische mogelijkheden van bijvoorbeeld een mutant of gekwetste muis toestaan ​​dergelijke beoordeling. Prestaties op een doolhof taak die kracht en coördinatie, zoals de Morris water maze, kan goed in een muis worden aangetast door motor, in plaats van cognitieve stoornissen, dus is het essentieel om selectief ontleden deze het eerste. Bijvoorbeeld, sensorimotorische stoornissen veroorzaakt door NMDA antagonisten het water maze performance ² beïnvloeden.

Motorische coördinatie is van oudsher bij muizen en ratten beoordeeld door de rotarod test, waarbij het dier wordt geplaatst op een horizontale staaf die draait om de lengteas; moet het dier naar voren lopen om overeind te blijven en niet vallen.Zowel de ingestelde snelheid en de versnelling versies van de rotarod beschikbaar.

De andere drie proeven beschreven in dit artikel (horizontale balk, statische staven en parallelle staven) alle coördinerende maatregel op statische apparaten. De horizontale balk vereist ook sterkte voor adequate prestaties, met name van de voorpoten als de muis in eerste instantie grijpt de bar alleen met de voorpoten.

Volwassen ratten niet goed presteren op tests, zoals de statische staven en parallelle staven (persoonlijke observaties), ze lijken minder goed gecoördineerd dan muizen. Ik heb alleen getest mannelijke ratten, echter, en mannelijke muizen lijken over het algemeen minder goed gecoördineerd dan vrouwtjes. Muizen blijken een hogere sterkte hebben: gewichtsverhouding dan ratten, de Latijnse naam, Mus musculus, lijkt volkomen terecht. De rotarod, zijn de variaties van de voetfout proef ¹² of de Catwalk (Noldus) ¹⁵ apparaten over het algemeen gebruikt om motorische coördinatie te beoordelen bij ratten.

Inleiding

Gedrag wordt gemanifesteerd door de actie, en actie vereist motorische vaardigheden, met inbegrip van de coördinatie van het lichaam. Een van de eerste experimenten in de geschiedenis van het gedrag van dieren werd uitgevoerd door Colin Stewart, een doctoraal student aan Clark University in de VS ^11. Hij mat de activiteit van ratten door ze in een trommel en telde het aantal keren bleek. Deze vroege apparaat was waarschijnlijk de voorloper van de loopwielen en de momenteel gebruikte rotarod test, zij het in de Stewart apparaat de rat was in de trommel, waarvan de beweging werd gedreven door de rat, terwijl in de rotarod het dier loopt aan de buitenkant van een roterende trommel of stang die motor aangedreven.

De oorspronkelijke staaf gebruikt door Dunham en Miya (1957) ⁷ had een ingestelde snelheid, maar tegenwoordig versnelde versies (Jones en Roberts 1968) ⁹ beschikbaar. Het nadeel van een ingestelde snelheid rotarod is dat sommige dieren met een slechte coördinatie af zal vallen bijde start, terwijl voor degenen die wel blijven, de test zal binnenkort beginnen aan uithoudingsvermogen in plaats van de coördinatie op zich te meten. De resulterende bimodale verdeling van datapunten kan voldoende abnormaal zijn als om parametrische analyse uitgesloten. Wanneer een versnelling rotarod wordt gebruikt, vooral als het wordt versneld wanneer een set criteria, zoals een verblijf gedurende 10 seconden wordt bereikt, gegevensverspreiding is waarschijnlijk Gaussian. De acceleratie kan worden aangepast zodat de motor vermoeidheid geen significante rol in de prestaties te spelen, een muis is waarschijnlijk niet aanzienlijk vermoeid na slechts 2-3 minuten tijd op de rotarod.

De "string test" ^1, "kleerhanger test" of horizontale balk meet voorpoot kracht en coördinatie. De twee epitheta geciteerd verwijzen naar zijn ontwikkeling; oorspronkelijk een string werd gebruikt, maar de auteurs opgemerkt dat de prestaties hing erg af van hoe strak de snaar was, vandaar toekomstige onderzoekers gebruikten een metalen staaf, vaak een kleerhanger. Wij hebben gevonden dat het vermogen van een muis om de bar grip is omgekeerd evenredig met de diameter en hebben standaard gebruikt een 2 mm bar. In de gewichten test (zie Jove protocol "Het meten van de sterkte van muizen") de zeer fijne draad van een waterkoker bont / schaal verzamelaar laat de sterkste dieren om zo'n goede grip dat ze meer dan hun eigen lichaamsgewicht kan tillen beveiligen. Het gebruik van grotere diameter horizontale balken kan een voordeel zijn als de gevoeligheid van de test verbeteren, met slechts een staaf 2 mm meeste normale C57BL / 6 muizen prestatie maximum bereiken. Daarom hebben we onlangs drie bar inrichting aangenomen de bars gemakkelijk verwisseld als ze passen in inkepingen gesneden in de toppen van de ondersteunende kolommen. De staven worden onder spanning gehouden (vooral belangrijk om de 2 mm bar stevigheid te) zij passen alleen de uitsparingen wanneer de steunen enigszins samengetrokken (zoals een longbow en string) (zie figuur 3).

Statische staven of balken zijn vaak gebruiktom de coördinatie te meten, maar extra motivatie werd altijd gebruikt om de dieren te overtuigen om de staaf doorkruisen. Ze onderhandeld over een horizontale balk om een ​​gewenst doel, zoals de kooi, toevluchtsoord van een fel licht, of voedsel (als ze honger heeft gemaakt) te bereiken. Echter, in de loop van het onderzoek naar dit type test, ik ontdekte dat muizen spontaan zou omdraaien bij plaatsing op de "open" einde van een vrijdragende staaf, en dan doorkruisen totdat ze bij de ondersteunde einde. Deze techniek elimineert de behoefte aan training (noodzakelijk de reeds vernoemde varianten) als aangeboren reactie van een muis wordt geplaatst aan het einde van een verhoogde staaf te proberen de ondersteunde einde te bereiken. Dit betekent natuurlijk niet, elimineren het probleem dat motivationele veranderingen prestaties kunnen beïnvloeden, dat is altijd een mogelijkheid om met dit soort procedure.

Kartonnen tunnels worden momenteel veel gebruikt voor thuis kooi milieu verrijking, maar hun nadeuitkijkpunt in de huidige context is dat dieren onvermijdelijk zal worden beoefend in evenwicht brengen op flessen die kunnen wiebelen over hun lange as, het nabootsen van de vaardigheden die nodig zijn om het evenwicht op de rotarod. Zo kooi verrijking zou kunnen maskeren een gedragsfenotype, een voorbeeld is van een verbetering van de ziekte van Huntington fenotype door verrijking ^14. Ook dieren lopen vaak langs de lange as van deze tunnels, zoals bij het lopen langs een verhoogde statische balk. Derhalve berekend I een paar verhoogde brug, en de muizen geplaatst in het midden met de voorpoten op een staaf en de achterpoten anderzijds, hetgeen zouden zij nooit tegengekomen. Muizen hadden tot het einde steunt van de parallelle staven bereiken terwijl rechtop blijven om de test te slagen. Een enigszins soortgelijke inrichting was een reeks van parallelle staven in een muis kooi geplaatst om de ontwikkeling van scrapie-geïnduceerde motorische stoornissen ¹³ te beoordelen.

We hebben nu getest een paar honderdmuizen voor motorisch functioneren in Oxford. Deze had diverse behandelingen, waaronder farmacologische middelen, of passieve overdracht van weefsel (plasma) van de mens ontvangen, maar meestal genetisch gemodificeerde dieren. Sommige dieren werden meer aangetast op sterkte dan coördinatietaken, anderen vice versa. Sommige muizen waren meer aangetast op het rotarod dan op statische substraten zoals de statische staven en parallelle staven, anderen vice versa. Dus dit artikel en de bijbehorende Jove protocol "Meten kracht bij muizen") wordt beschreven hoe u de manier waarop verschillende behandelingen en mutaties kunnen differentieel invloed motorische functie in muizen te karakteriseren. Naast de rotarod de hier beschreven inrichting is eenvoudig, goedkoop en bijzonder geschikt voor laboratoria niet gespecialiseerd voor het testen motoriek. Voor fijn-schaal ganganalyse, de Catwalk systeem is een veel geavanceerder systeem dan oudere methoden zoals overtuigen een muis te lopen door een inkt bad en dan naar beneden een stuk papier, maar het is een expensive stuk van de apparatuur.

Al deze tests zijn bedoeld om de coördinatie in plaats van kracht te meten, hoewel natuurlijk een minimale mate van spierspanning nodig is gewoon voor de muis om zijn ledematen te gebruiken. Voor kracht evaluatie, de omgekeerde scherm procedure ¹⁰ is meer geschikt, of, indien een meer graduele meting vereist is, de gewichten testen of de geautomatiseerde bar-pull equivalent (in Jove protocol "Het meten van de sterkte bij muizen" beschreven). De uitzondering is de horizontale balk test, die zowel de kracht en coördinatie voor succesvolle prestaties vereist.

Protocol

1. Apparaat

Voor alle proeven wordt een zachte zacht oppervlak geplaatst aan de basis van de inrichting alle muizen die vallen vangen. NB Dit is niet getoond in de figuren, zodat geen onderdelen van de inrichting verduisteren. Tijdens het testen van honderden muizen, zowel normale en mutante, we hebben nog nooit enig letsel veroorzaakt door het vallen van een dergelijke inrichting, die typisch is 30-50 cm hoog waargenomen. Zorg er ook voor het reinigen en steriliseren van de apparatuur tussen elke muis getest.

1.1 Rotarod

Er zijn verschillende commerciële versies van deze apparaten in de handel, maar sommige hebben nadelen, zoals niet te versnellen op een voldoende snelheid motor incoordination (plaats endurance) detecteren. Een andere veel voorkomende fout is dat de staaf is niet hoog genoeg boven de basis, wat resulteert in muizen neiging om vallen of springen.

De in figuur 1 rotarod werd het ontwerpvan de auteur door de technische afdelingen van de afdeling Farmacologie, Universiteit van Oxford. De stang 3 cm in diameter, ondersteund 30 cm boven de onderkant van de inrichting. Het oppervlak is gekarteld in een reeks parallelle richels langs de lengteas, zodat de muizen om effectief te grijpen (Figuur 2). NB De diepte van de ruggen is een essentieel detail, als de muis een goede grip niet kunt krijgen de test zal veel moeilijker zijn, aan de andere kant, als de grip is te goed de muis zal "cartwheel" om de pen passief houden aan het. Voor "amateur rotarod makers" het nuttig kan zijn om dat gekartelde houten Vastpennen van de maat voor muizen in de handel verkrijgbaar, maar zou natuurlijk moeten worden behandeld met een goede waterdichte vernis voor gebruik. De startsnelheid is ingesteld op 4 rpm, de acceleratie tot 20 toeren / min. Maximale snelheid is 40 rpm.

Twee flenzen voorkomen muis verlaten de staaf. Ze zijn 30 cm in diameter (ditkan waarschijnlijk worden verminderd tot 20 cm). De scheiding wordt ingesteld op 6 cm (maximum) maar moet kleiner worden aangepast voor sub-volwassen muizen als ze de neiging om te draaien op de stang.

1.2 Triple horizontale balken (figuur 3)

De staven zijn gemaakt van messing, 38 cm lang, die 49 cm boven het oppervlak van een bank kolom houten steun aan elk uiteinde. De kolommen zijn bevestigd aan een zware houten basis. Drie bar diameters zijn beschikbaar: 2, 4 en 6 mm. De mm balk 2 is de standaard die we gebruiken, maar veel muizen bereiken maximale scores op deze. Daarom grotere diameter bars zijn in een poging om de test te verfijnen, zoals muizen kan grijpen deze zo goed.

1.3 Statische staven

Vijf houten deuvels of staafjes van verschillende dikte (35 (rod 1), 28, 22, 15 en 9 (stang 5) mm diameter) elk 60 cm lang worden vastgesteld door een G-klem naar een laboratorium plank zodanig dat de staven horizontaal uitsteken de ruimte (figuur 4). Het eindevan de staaf in de buurt van de bank heeft een merkteken 10 cm van het uiteinde, om de eindstreep te duiden. De hoogte van de staven boven de vloer is 60 cm.

Als een kortere en minder gedetailleerde test vereist, gebruik dan alleen de grootste, kleinste en middelste staven. Van Dellen et al.. ¹⁴ gebruikt slechts een staaf om de voortgang van de ziekte van Huntington in muizen te evalueren.

1.4 Parallel bars

Twee parallelle staven 1 m lengte en 4 mm in diameter zijn vast 30 mm (op hun centra) elkaar door houten steunpilaren aan hun uiteinden (figuur 5). De bars zijn 60 cm boven de vloer.

2. Procedure

Voor alle testen, breng muizen aan de experimentele kamer 5-20 min voor het testen, om te garanderen dat ze volledig wakker. Als algemene regel, om het herstel van spierkracht en een terugkeer naar normale niveaus van arousal toestaan, rusten de muizen door een terugkeer naar de kooi na elke motor te testen.

2.1 Rotarod

Stel de rotarod met een startsnelheid van 4 toeren, versnelling 20 toeren / min. Houdt de muis bij de staart, en plaats deze op de roterende staaf, afgekeerd van de draairichting dus het heeft om vooruit te lopen om overeind te blijven. Dit eenvoudigst als de muis omhoog wordt gebracht naar de stang een hoek van 45 ° onder de horizontaal, probeert de muis verlagen van hierboven zal resulteren in het spreiden zijn achterpoten en grijpen de randen van de flenzen. Snel de muis loslaat wanneer het bijna tegen de stang, net vóór en boven de staven bovenste dode punt, waardoor het gemakkelijk grijpen de stang. A (waarschijnlijk gemakkelijker en betrouwbaarder) techniek is een dun (10-15 mm) plug gebruikt. Houd de muis in een hand, omlaag naar de plug, parallel aan de lange as. De plug onder een hoek staat van de muis onderste boven ongeveer 30 ° om het meer tijd om de rotarod grijpen mits ontgrendeld geven. Laat de muis en pluggen tussen the flenzen van de rotarod, en een keer over de roterende staaf de trek de plug naar beneden weg van de muis, die de roede zal begrijpen en loop naar voren.

Op 10 seconden na het plaatsen van de muis op de stang, start versnelling (zolang de muis is naar voren gericht: zo niet, wachten tot het doet gezicht vooruit voordat versnelling), en let op de snelheid waarmee de muis loslaat. Als het eraf valt vóór 10 sec, let op de tijd van de val en probeer het opnieuw, tot drie keer in totaal, het registreren van de snelheid op de eerste daling na de 10 sec punt. Echter gelegen vóór 5 sec die wegens slechte plaatsing van de experimentator niet opgenomen. De gemiddelde snelheid val is gegeven, in plaats van de maximum snelheid, dit corrigeert de extra praktijk van de muis tijdens de mislukte runs, waarvan wordt aangenomen zou verbeterd worden ontvangen. Dus een muis die vóór 10 sec valt blijft een keer dan op tot 12 rpm de tweede keer scoort (4 +12) / 2 = 8 rpm. Een muis vallen twee keer danverblijf op 10 rpm scores (4 +4 +10) / 3 = 6 rpm. Als een muis niet aan grip in 10 seconden drie keer toe het een score van 4 tpm.

Een probleem is dat muizen soms stoppen met lopen naar voren en greep de staaf stevig in plaats, zodat ze passief salto ronde, hoewel de meeste uiteindelijk af vallen. Het zou daarom nuttig zijn om ook op de snelheid bij de eerste dergelijke inversie optreedt. Een mogelijke oplossing zou kunnen zijn om een ​​staaf te gebruiken met een grotere diameter of minder uitgesproken ribbels.

2.2 Horizontale tralies

Omdat muizen vinden aanbevolen de smalle 2 mm bar vatten, is het raadzaam ze eerst te testen op deze. Houdt de muis bij de staart, plaats het op de bank voor het apparaat, schuif deze snel achteruit ongeveer 20 cm (dit stemt het loodrecht op de bar), snel te verhogen en laat het begrijpen van de horizontale balk op het centrale punt met haar voorpoten alleen, en laat de staart, gelijktijdig starten van de stopclock. Deze cEen moeilijk om efficiënt te bereiken; sommige muizen grip beter als de staart plotseling wordt losgelaten, als ze het gevoel dat ze worden nog ondersteund kunnen zij niet aan grip. Het criterium punt is ofwel een daling van de bar voordat de muis bereikt een van de uiteinde kolommen van de bar, of de tijd totdat ene voorpoot raakt een column. Maximale duur van de proef (cut-off time) is 30 sec.

Als de muis niet de bar goed eerst grijpen en dit blijkt te wijten aan techniek wordt de experimentator, in plaats van de muis opnieuw proberen (na een korte rust terwijl nog een of twee muizen getest) en kan deze daling opnemen. Als de muis gelegen vóór 5 sec en dat blijkt niet te wijten aan slechte plaatsing door de experimentator, herhaal tot drie keer in een poging om een> 5 sec score. Indien> 5 sec op de tweede poging, doe het niet een derde proef. Neem de beste score als het referentiepunt. Een muis die herhaaldelijk niet aan zichzelf te ondersteunen voor> 5 sec scoort slechts 1.

Als de triple-bar versie wordt gebruikt, als de muis scoort 5 op deze eerste 2 mm balk kan vervolgens worden getest op dikker bars, na een korte rustperiode, terwijl een ander een of twee muizen worden getest. Het scoresysteem voor 4 en 6 mm bars is hetzelfde als voor de 2 mm bar en de eindstand is het gecumuleerde totaal. Dus een muis die scoort 5 op de 2 mm-bar, maar valt uit de 4 mm bar na 13 sec scores 5 +3 = 8.

2.2.1

Scoren de horizontale balken: de eerste twee intervallen zijn minder dan de laatste twee als eenmaal de muizen aanvankelijk beheerst de taak ze minder kans om te vallen:
Vallen tussen 1-5 sec = 1
Vallen tussen 6-10 sec = 2
Vallen tussen 11-20 sec = 3
Vallen tussen 21-30 sec = 4
Vallen na 30 sec = 5
Het plaatsen van een voorpoot op een balk ondersteuning zonder te vallen = 5

NB als het facultatieve gebruik van 4 en 6 mm bars is een nieuwe toevoeging aan ons protocol we nog niet hebben uitgebreideervaring met hen.

2.3 Statische staven

Plaats de muis op het verre eind van de breedste stang (lengte neuspunt een hoofd van het einde is ideaal). Neem twee maatregelen: oriëntatie (tijd genomen om 180 ° oriënteren vanuit de startpositie naar de plank) en doorvoer (de tijd genomen om te reizen naar de plank einde (neus voorbij de 10 cm merk uit het schap einde van de stang).

Oriëntatie is afhankelijk van de muis rechtop blijven, als blijkt ondersteboven en klampt zich vast onder de stang, willekeurig toewijzen (voor statistische doeleinden) de maximale oriëntatie score van 120 sec. Niet testen op kleinere staven, ook de looptijd wordt de maximale waarde als een muis die rechtop doortrekt is duidelijk beter gecoördineerd dan een die doortrekt, terwijl opknoping op zijn kop.

Indien, na oriënteren, de muis valt of zij de maximale duur van de proef (arbitrair op 120 sec) bereikt niet testen op sMaller staven. Voor statistische doeleinden, worden assign muizen vallen toegewezen 120 voor die specifieke staaf en toegestaan ​​voor volgende, omdat er wordt aangenomen dat ze zou opnieuw van een smallere staaf vallen. Als de muis ondersteboven draait, ook rekening mee dat dit evenement voor succesvolle doorvoer alsmede oriëntatie dient overeind te blijven op de stang. Anderszins over te dragen van de maximale score. Verwijder de muis na het einde van de stang of vallen bereikt.

Na het testen op een hengel terug op de muis om de kooi te rusten terwijl u een andere muis testen. Plaats het dan op de eerstvolgende kleinere staaf en test het weer op dezelfde manier. Stop testen als de muis valt een staaf na op het voor meer dan 5 sec. Als het viel in minder dan 5 seconden te vervangen en laat nog een poging (als die binnen 5 sec kan te wijten zijn aan foutieve plaatsing door de experimentator), voor maximaal drie proeven, en gebruik het beste resultaat.

2.4 Parallel bars

Plaats de muis in thij midden van de twee staven zijn lengteas loodrecht op die van de staven, beide voorpoten moet op een staaf, beide achterpoten anderzijds bar. Scoring is vergelijkbaar met die voor de statische staven. Neem twee maatregelen: de tijd genomen totdat de muis oriënteert 90 ° naar de startpositie en de tijd totdat het later bereikt een van de uiteinde ondersteunt. Als de muis ondersteboven draait, ook rekening mee dat dit evenement. Als voor de statische staven test, oriëntatie-en doorvoer moet worden bereikt zonder het te draaien op zijn kop, anders wordt de maximale tijd wordt toegewezen. Het komt zelden voor redelijk gezonde muizen te vallen in minder dan 5 seconden; als dit wel gebeurt is het waarschijnlijk te wijten aan een slechte plaatsing. Dus gooi het resultaat en test de muis.

Resultaten

Verwachte resultaten

Een statische staaf werd oorspronkelijk gebruikt om de voortgang van de ziekte van Huntington te volgen in mutante muizen, met of zonder het milieu verrijking in hun eigen kooien ^14. Het verrijkingsprogramma dramatisch vertraagde het begin van motorische disfunctie op de stang, die ging gepaard met een vertraging in het begin van de achterpoot omklemde, een algemeen teken van neurologische stoornissen.

Scrapie besmette muizen vertoonden een afname in horizontale balk prestaties van week 16 na de injectie, in rotarod testen van week 18, en statische staven van minstens week 19 ⁸ (vroeger testen werd niet uitgevoerd). KATP kanaal subeenheid Kir6.2 KO muizen waren beschadigd op de statische staven en horizontale balk, maar niet op de rotarod ^4. Hippocampale laesies geen invloed op maat motoriek ^5, maar 129S2/Sv muizen aangetast ten opzichte van de C57BL / 6 stam op de rotarod en statische staven ^3. C57BL/10 muizen hadden ook slechtere motorprestaties dan C57BL / 6 muizen ^6, hoewel niet in dezelfde mate als 129S2/Sv muizen.

Figuur 1. De rotarod.

Figuur 2. Detail van de gekartelde staaf van de rotarod.

Figuur 3. De drievoudige horizontale balken De bar gehouden in de inkepingen is de basis 2 mm een;. Overstag eronder (alleen voor demonstratie-doeleinden) zijn de 4 en 6 mm bars. In de praktijk wordt slechts een bar tegelijk verzonken in de schuine steunen.

Figuur 4. Een muis doorkruisen van een statische staaf.

Figuur 5. Een muis op de parallelle staven. Padding is weggelaten alleen ter demonstratie.