$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Epitheliale cellen polariseren hun plasmamembraan in biochemisch en functioneel verschillende apicale en basolaterale domeinen waar de apicale domeinnaam wordt geconfronteerd met de 'vrije' oppervlakken en de basolaterale membraan is in contact met de ondergrond en de naburige cellen. Beide membraan domeinen zijn van elkaar gescheiden door tight junctions, die een diffusie barrière vormen. Apicale-basolaterale polarisatie met succes kunnen worden samengevat in de cultuur als epitheliale cellen zoals Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellen worden gezaaid met een hoge dichtheid op polycarbonaat filters en gekweekt gedurende enkele dagen een twee. Opzetten en onderhouden van celpolariteit wordt geregeld door een reeks van kleine GTPases van de Ras superfamilie, zoals Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 en Rab13 3 4 5 6 7. Net als alle GTPases deze eiwitten cyclus tussen een inactieve GDP-gebonden toestand en een actieve GTP-gebonden toestand. Specifieke mutaties in de nucleotide binding regio's interfereren met deze fiets 8. Bijvoorbeeld, is Rab13T22N permanent opgesloten in het BBP-vorm en dus noemde 'dominant negatief', terwijl Rab13Q67L niet meer kan hydrolyseren GTP en is dus opgesloten in een staat 'dominante actief' 7. Voor het analyseren van hun functie in de cellen zowel dominant negatief en dominant actieve allelen van GTPases zijn meestal uitgedrukt in hoge mate te bemoeien met de functie van de endogene eiwitten 9. Een elegante manier om een hoog niveau van overexpressie in een korte tijd te bereiken is de invoering van de plasmiden die coderen voor de relevante eiwitten direct in de kernen van gepolariseerde cellen gekweekt op filter ondersteunt het gebruik van micro-injectie techniek. Dit wordt vaak gecombineerd met de co-injectie van de reporter-plasmiden die plasma membraan receptoren die specifiek zijn gesorteerd naar de apicale of basolaterale domeinnaam coderen. Een lading vaak gebruikt om lading te analyseren sorteren aan de basolaterale domein is een temperatuur gevoelig allel van de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSVGts045) 10. Dit eiwit kan niet goed voudig bij 39 ° C en zal dus worden bewaard in het endoplasmatisch reticulum (ER), terwijl de regulerende eiwit van belang is gemonteerd in de cytosol. Een verschuiving naar 31 ° C zal dan de mogelijkheid VSVGts045 goed te vouwen, laat de ER en reizen naar de plasmamembraan 11. Dit jacht is meestal uitgevoerd in de aanwezigheid van cycloheximide om verdere eiwitsynthese die leidt tot schoner resultaten te voorkomen. Hier beschrijven we in detail de procedure van microinjecting plasmiden in gepolariseerde cellen en de daaropvolgende incubaties inclusief temperatuur verschuivingen die een uitvoerige analyse van regulerende eiwitten die betrokken zijn bij basolaterale sorteren mogelijk te maken.