Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

Samenvatting

Om de interactie van een proteïne test met haar doel lipide gebruikten we MACS en Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en lipide vesicles gesynthetiseerd uit het doel lipiden en Annexine V-bindend fosfatidylserine. Eiwitten gebonden aan de doelgroep lipide zijn co-gezuiverd en geanalyseerd na elutie van de kralen.

Samenvatting

De analyse van lipide-eiwit interacties is moeilijk omdat lipiden zijn ingebed in celmembranen en daarom ontoegankelijk voor de meeste zuivering procedures. Als alternatief kunnen lipiden worden gecoat op vlakke oppervlakken zoals gebruikt voor het lipide ELISA en Plasmon resonantie spectroscopie. Echter, coating lipiden vormen geen microdomain structuren, die belangrijk kan zijn voor de lipide bindende eigenschappen. Verder zijn deze methoden niet toe dat voor de zuivering van grotere hoeveelheden eiwitten te binden aan hun doel lipiden.

Om deze beperkingen van het testen van lipide-eiwit interacties en het lipide-bindende eiwitten te zuiveren ontwikkelden we een nieuwe methode genoemd lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van magnetische-geactiveerde cel sortering (LIMACS). Bij deze methode zijn lipide blaasjes bereid met het doel lipiden en fosfatidylserine als anker voor de lipide Annexine V MACS. Fosfatidylserine is een alomtegenwoordige celmembraan fosfolipide dat een hoge affiniteit voor het eiwit annexine V. Met behulp van magnetische korrels geconjugeerd aan Annexine V de fosfatidylserine-bevattende lipide vesicles zal binden aan de magnetische korrels laat zien. Als de lipide vesicles worden geïncubeerd met een cellysaat het eiwit binding aan het doel lipide zal ook gebonden aan de kralen en kan mede worden gezuiverd met behulp van MACS. Deze methode kan ook gebruikt worden om te testen of recombinante eiwitten reconstrueren een eiwit complex binding aan het doel lipide.

We hebben gebruik gemaakt van deze methode om de interactie van atypische PKC (aPKC) show met de sfingolipide ceramide en om samen te zuiveren prostaat apoptose respons 4 (PAR-4), een eiwit binding aan ceramide-geassocieerde aPKC. We hebben ook gebruik gemaakt van deze methode voor de reconstructie van een ceramide-geassocieerd complex van recombinant aPKC met de celpolariteit-gerelateerde eiwitten Par6 en Cdc42. Omdat lipide vesicles kunnen worden bereid met een verscheidenheid van sphingo-of fosfolipiden, LIMACS biedt een veelzijdige test voor lipide-eiwit interacties in een lipide omgeving die sterk lijkt op die van de celmembraan. Extra lipide-eiwit-complexen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van proteomics analyse van de lipiden bindend eiwit co-gezuiverd met het lipide blaasjes.

Protocol

1. Introductie

De lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van magnetische-geactiveerde cel sortering (LIMACS) techniek werd ontwikkeld in ons laboratorium te isoleren ceramide-geassocieerde eiwitcomplexen ^1-3. Oorspronkelijk werden de lipide vesicles gemaakt van ceramide en fosfatidylserine, waardoor voor het MACS met behulp van magnetische deeltjes-geconjugeerd Annexine V (zeer affiene om fosfatidylserine) om de blaasjes en de bijbehorende eiwitten te isoleren. We hebben de LIMACS techniek voor de in vitro reconstitutie van een ceramide-geassocieerd polariteit complex en de isolatie van ceramide-bindende eiwitten uit cellysaten ^3. LIMACS kan worden gewijzigd met behulp van andere interactiepartners voor de isolatie van de blaasjes (bijvoorbeeld glycolipide-specifeke lectinen of lipide antilichamen).

2. Experimentele procedures

Voorbereiding van lipide vesicles en aPKCBinding Assays

1. Lipide blaasjes worden verkregen uit gedroogde mengsels van equimolaire hoeveelheden van fosfatidilserine (105 pg) en de C16-ceramide (85 ug) volgende gewijzigde procedures voor grote liposoom voorbereiding ^1,4-7.
2. De lipide mengsels zijn vervolgens geresuspendeerd en gesoniceerd gedurende 1 uur in 100 ul blaasje buffer die bestaat uit 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) en 150 mM NaCl.
3. Na het toevoegen van 300 pi van blaasje buffer aangevuld met 0,1 mM MnCl _2, worden de monsters gecentrifugeerd bij 12.000 μ g gedurende 20 min bij 4 ° C.
4. De pellet (grote lipide blaasjes) wordt opnieuw gesuspendeerd in 100 ul van blaasje buffer en geïncubeerd met een nmol van Vybrant CM-dii gedurende 1 uur bij 37 ° C om de blaasjes fractie na scheiding MACS te visualiseren. Vybrant CM-dii is een rode fluorescente kleurstof die specifiek te nemen in lipide membranen.
5. Een detergent-vrije cellysaat wordt bereid door sonicatie / homogenisering van de cellen in 300 ul van hypotone buffer (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) met protease-inhibitoren en fosfatase), gevolgd door het verwijderen van membraneuze puin door middel van centrifugeren. Een centrifugatie stap bij 100.000 xg gedurende 1 uur moet worden toegevoegd om verontreiniging van het cellysaat met endogene membranen die fosfatidylserine te voorkomen.
6. De gewist lysaat wordt toegevoegd aan de lipide bolletjes ophanging, en het mengsel wordt gedurende 2 uur bij 4 ° C.
7. Het reactiemengsel wordt aangevuld met 20 ul van 20x Annexine V bindingsbuffer en 50 ul van een oplossing met magnetische korrels geconjugeerd aan Annexine V gevolgd door incubatie gedurende 1 uur bij 4 ° C.
8. MACS is uitgevoerd volgens de fabrikant (Miltenyi Biotec, Inc) protocol. De aanwezigheid en hoeveelheid van lipide vesicles wordt bepaald door het toezicht op de Vybrant CM-dii fluorescentie in de flow-through en elutie fracties met behulp van een microplaat fluorescentie lezer.
9. De lineaire correlatie tussen de hoeveelheid van vesiculaire vet-en fluorescentie-intensiteit van vesikel-gebonden Vybrant CM-dii is geverifieerd door kwantitatieve high-performance thin-layer chromatografie (HPTLC) van de lipide mengsel toegepast op Annexine V-gebaseerde Macs.
10. De specificiteit van de binding reactie van aPKC of andere eiwitten aan het ceramide / fosfatidylserine blaasjes wordt gecontroleerd door een antilichaam concurrentie test met behulp van 1 ug van het anti-PKCζ konijn polyklonaal antilichaam aan de cel lysaat gedurende 1 uur incuberen bij 4 ° C voorafgaand aan de incubatie met de lipide blaasjes.
11. Het eiwit binding aan ceramide / fosfatidylserine blaasjes in de MACS eluaat wordt geanalyseerd door SDS-PAGE en immunoblotting.

In vitro lipide-eiwit polariteit complex

1. De in vitro reconstitutie van een lipide-eiwit polariteit complex is uitgevoerd volgens de LIMACS procedure zoals beschreven in de vorige paragraaf. In het kort, phosphatidylserine (420 pg) en de C16-ceramide (107 ug) wordt gedroogd van organische oplosmiddelen.
2. De gedroogde lipiden zijn geresuspendeerd onder sonicatie in 500 pi van vesicle buffer (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).
3. Vijf ul van 10 mM MnCl2, 1 ui Vybrant CM-dii, en 500 ng van PKCζ (menselijke recombinant) wordt toegevoegd en het reactiemengsel geïncubeerd undergentle agitatie gedurende 60 min bij 4 ° C.
4. Vybrant CM-dii-lood fosfatidylserine / ceramide blaasjes worden teruggewonnen door middel van centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 60 min bij 4 ° C.
5. De pellet (roze) is geresuspendeerd in 100 ul Tris-buffer en aangevuld met γS-GTP (100 uM), het BBP (1 mm), GST-Par6 (100 ng), of GST-Cdc42 (500 ng) en verder geïncubeerd gedurende 3 h bij 4 ° C (een andere combinatie van recombinante eiwitten van belang kan hier worden gebruikt).
6. Annexine V-buffer (5 ul van een 20x voorraad-oplossing) en Annexine V-geconjugeerde magnetische korrels (50 ul) toegevoegd en het reactiemengsel geïncubeerd onder zacht schudden voor nog eens 30 min bij 4 ° C.
7. Annexine V-MACS is uitgevoerd volgens het protocol van de leverancier zoals eerder beschreven.
8. De elutie fractie (1 ml) is aangevuld met 10 ug van pure ovalbumine als neerslag hulp. Het eiwit wordt geconcentreerd door Wessel-Flugge neerslag en geanalyseerd door SDS-PAGE/immunoblotting zoals eerder beschreven ^8.
9. De hoeveelheid geëlueerd lipide vesicles wordt gekwantificeerd door de detectie van Vybrant CM-dii (roze) in de organische (chloroform / methanol) fase van het Wessel Flugge neerslag reactie. De hoeveelheid van de geanalyseerde eiwit is genormaliseerd op gelijke hoeveelheden van lipide blaasjes.

3. Resultaten

LIMACS zuivering van PKCζ-EGFP en de ceramide bindingsdomein C20ζ-EGFP

Een detergent-vrije lysaat van MDCK cellen die volledige lengte PKCζ C-terminaal gekoppeld aan groen fluorescerend eiwit (FLζ-EGFP) of een ceramide bindend domein in het C-terminus van PKCζ (C20ζ-EGFP) werd geïncubeerd met phosphatidylserine / ceramide blaasjes als beschreven in de experimentele procedures. Na elutie van de MACS kolom, werd geanalyseerd met behulp van eiwit immunoblotting en antistoffen tegen PKCζ en EGFP voor de detectie van het eiwit geëlueerd ^2.

Figuur 1. LIMACS van EGFP-gelabeld PKCζ en de C-terminale fragment C20ζ met fosfatidylserine / ceramide blaasjes.

Detergent-vrije lysaten van MDCK cellen die EGFP (als een niet-bindend control), volledige lengte PKCζ-EGFP, of de ceramide binding, C-terminale fragment C20ζ-EGFP werden geïncubeerd met phosphatidylserine / ceramide blaasjes, zoals beschreven in de experimentele procedures sectie . Na het gebruik van LIMACS, werd eiwit geëlueerd met SDS sample buffer en geanalyseerd door SDS-PAGE en immunoblotting. Het linker paneel toont aan dat EGFP niet binden aan de blaasjes behouden met de Annexine V-linked magnetische korrels. De middelste en rechter paneel toont aan dat de volledige lengte PKCζ-EGFP en C20ζ-EGFP werden behouden door binding aan ceramide.

Discussie

Voor het testen van de specifieke interactie tussen een lipide en zijn bindend eiwit wordt belemmerd door inbedding van lipiden in het celmembraan. De celmembraan bestaat uit een mengsel van verschillende vetten en eiwitten en het is georganiseerd in lipide microdomeinen of vlotten. Daarom kan de co-zuivering van microdomeinen en eiwitten niet duidelijk onderscheiden of een eiwit direct bindt aan een lipide of slechts verrijkt met een microdomain structuur. Andere methoden met behulp van bepaalde lipiden gecoate op oppe...

Materialen