Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

Samenvatting

De neuromusculaire junctie (NMJ) van Drosophila melanogaster Is een belangrijk model voor het bestuderen van een normale synaptische functie en storingen aan synaptische functie vinden in bepaalde neurologische aandoeningen. We presenteren een protocol voor dissectie van de Drosophila Larvale motoriek en immunokleuring voor actieve zone eiwitten binnen de NMJ.

Samenvatting

De Drosophila larven neuromusculaire junctie (NMJ) is een uitstekend model voor de studie van synaptische structuur en functie. Drosophila staat bekend om het gemak van krachtige genetische manipulaties en het larvale zenuwstelsel heeft bewezen vooral nuttig bij het ​​bestuderen van niet alleen de normale functie, maar ook storingen die gepaard gaan met een aantal neurologische aandoeningen (Lloyd en Taylor, 2010). Veel belangrijke synaptische moleculen gevonden in Drosophila zijn ook gevonden in zoogdieren en zoals de meeste CNS synapsen excitatoire in zoogdieren, de Drosophila NMJ is glutamaat en vertoont ook een activiteit-afhankelijke remodeling (Koh et al.., 2000). Bovendien kan Drosophila neuronen worden individueel geïdentificeerd omdat hun innervatie patronen stereotiepe en zich herhalende waardoor het mogelijk is om de vastgestelde synaptische terminals, zoals die tussen neuronen en het lichaam-muur spiervezels dat ze innerveren (Keshishian en Kim, 2004). Bestuderen Het bestaan ​​van evolutionair geconserveerd synaps componenten, samen met het gemak van genetische en fysieke manipulatie maken het Drosophila model ideaal is voor het onderzoek naar de onderliggende mechanismen van synaptische functie (Budnik, 1996).

De actieve zones op synaptische terminals zijn van bijzonder belang, omdat deze zijn de sites van neurotransmitters. NC82 is een monoklonaal antilichaam dat het Drosophila-eiwit Bruchpilot (BRP), een CAST1/ERC familielid, dat is een belangrijk onderdeel van de actieve zone (Wagh et al., 2006). Herkent. BRP bleek direct de vorm van de actieve zone T-bar en is verantwoordelijk voor het effectief clustering Ca ^{2 +-kanalen} onder de T-bar dichtheid (Fouquet et al.., 2009). Mutanten van Brp zijn verminderd Ca ^{2 +} kanaal dichtheid, depressief opgeroepen blaasje release, en veranderde op korte termijn plasticiteit (Kittel et al., 2006).. Wijzigingen in actieve zones zijn waargenomen in Drosophila ziekte modellen. Bijvoorbeeld, immunofluorescentie met behulp van de NC82 antilichaam bleek dat de actieve zone dichtheid was afgenomen in modellen van amyotrofe laterale sclerose en Pitt Hopkins-syndroom (Ratnaparkhi et al., 2008;. Zweier et al., 2009.). Zo kan de evaluatie van actieve zones, of andere synaptische proteïnen, in Drosophila larven van de ziekte van een waardevolle eerste aanwijzing voor de aanwezigheid van een synaptische defect.

Voorbereiden hele-mount ontleed Drosophila larven voor immunofluorescentie analyse van de NMJ vereist enige vaardigheid, maar kan worden bereikt door de meeste wetenschappers met een beetje oefening. Gepresenteerd, is een methode die zorgt voor meerdere larven worden ontleed en immunostained in dezelfde dissectie gerecht, het beperken van het milieu de verschillen tussen elk genotype en zorgen voor voldoende dieren voor vertrouwen in de reproduceerbaarheid en statistische analyse.

Protocol

1. Voorbereiding voor immunofluorescentie:

1. Voor het maken van een dissectie oppervlak, giet Sylgard 184 Siliconen Elastomeren Base in een kleine weefselkweek plaat. Zorg ervoor dat niet op de plaat te vullen volledig, zodat de dissectie gebied lager is dan de velg.
2. Trim dissectie pinnen tot een lengte van ongeveer 3,5 mm voor meer gemak van manipulatie, en zorg ervoor dat ten minste 6-pins per larve hebben.
3. U moet stompe tang waarmee u begrijpen de pinnen voor de dissectie.

2. Dissectie van Larven:

1. Selecteer zwervende derde instar larven die kruipen rond de zijkanten van de flacon en zijn ni....

Discussie

Voor neuronen, de synaptische terminal gebied is van cruciaal belang, en is de brug voor een goede communicatie tussen de post-en pre-synaptische cellen. Een krachtige manier om de gezondheid van het neuron te onderzoeken bij de ziekte van modellen is aan eiwitten van de synaptische terminal te analyseren door immunofluorescentie. De immunofluorescentie methode hier gepresenteerde Hiermee kan de onderzoeker een groot aantal larven tegelijk onderzoeken, terwijl het beperken van de ecologische verschillen tussen de groepe.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus Nummer	Reacties
Sylgard 184 Silicone elastomeer Base	Dow Corning	68037-59-2	Na het mengen zorgen voor luchtbellen te langzaam uit stijgen door het aantrekken van langzame rotator of toestaan ​​te zitten voor 30 minuten of meer.
Stainless Steel Minutien Pins	Fijn Science Tools	26002-10	Trim tot ca.. 3-4mm in lengte met gewone schaar
Laminectomie pincet (Blunt-Gebruikt voor grijpen pinnen)	Fijn Science Tools	11223-20	Gebruik als botte tangen voor het grijpen pinnen
Dissection Forceps	Wereld precisie-instrumenten	501985
Superfijn Vannas Schaar, 8cm lang	Wereld precisie-instrumenten	501778
Muis anti-Brp antilichaam	DSHB	NC82	Gebruik 1:50 verdunning
Cy3 Affinipure geit anti-mierikswortelperoxidase	Jackson Immunoresearch	123-165-021	Gebruik bij 1:200 verdunning
Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG	Invitrogen	A11001	Gebruik ca.. 1:200 verdunning