Een eenvoudige en betrouwbare methode op isolatie en de cultuur van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale corticale weefsel wordt beschreven. Culturen zijn afgeleid van bekende menselijke neurologische aandoeningen kunnen worden gebruikt voor de karakterisering van pathologische cellulaire en moleculaire processen, maar ook als een platform om de farmacologische werkzaamheid beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neurale stamcellen (NSCs) verblijven langs de ventriculaire zone neuroepithelium tijdens de ontwikkeling van de corticale plaat. Deze vroege voorouders uiteindelijk aanleiding geven tot intermediaire voorouders en later de verschillende neuronale en gliale cel subtypes dat de cerebrale cortex formulier. De capaciteit te genereren en uit te breiden menselijke NSCs (de zogenaamde neurospheres) uit afgedankte normaal foetaal weefsel een middel waarmee direct de studie van de functionele aspecten van de normale menselijke ontwikkeling van NSC 1-5. Deze aanpak kan ook worden gericht op het genereren van NSCs van bekende neurologische aandoeningen, waardoor bieden de mogelijkheid om ziekte processen die stamvader proliferatie, migratie en differentiatie 6-9 te veranderen te identificeren. Hebben we ons gericht op het identificeren van pathologische mechanismen in de menselijke het syndroom van Down NSCs die kunnen bijdragen aan de ziekte van Alzheimer versnelde fenotype 10,11. Zowel in vivo als in vitro de muis modellen kunnen repliceren de identieke repertoire van genen op menselijk chromosoom 21.
Hier gebruiken we een eenvoudige en betrouwbare methode om te isoleren het syndroom van Down NSCs van geaborteerde foetussen menselijke cortex en ze groeien in de cultuur. De methode biedt specifieke aspecten van het oogsten van de weefsel, dissectie met een beperkte anatomische oriëntatiepunten, cell sorting, beplating en de passage van de menselijke NSC. We bieden ook een aantal fundamentele protocollen voor het induceren van differentiatie van humane NSCs naar meer selectieve cel subtypes.
Protocol
1. De voorbereiding van oplossingen en materialen voor dissectie en het onderhoud van neurale stamcellen cultuur
- Bereid 100ml dissectie medium (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) van tevoren in de koelkast.
- Prepare100 ml kweekmedium (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) en houdt bij 37 ° C in een waterbad.
- Bereid cel-bevriezing medium (KNOCKOUT DMEM/F12 +10% FBS + 5% DMSO) voor lange termijn cryopreservatie van cellen.
- Indien gewenst, voor te bereiden 4% paraformaldehyde (PFA) voor weefsel fixatie.
- Steriel, geautoclaveerd pincet en scalpel bladen met handgrepen worden gebruikt voor dissectie.
- Vernietiging van een pipet pistool, 10 ml overdracht pipetten, en 40 uM cel zeef (BD Falcon 352.340) voor dissociatie.
- Gereserveerd diverse 10 cm kweekschalen (BD) voor dissectie, 50 ml centrifugebuis (BD) voor dissociatie, 1,5 ml centrifuge buizen voor weefsel opslag en bevroren flesjes (BD) voor het invriezen van cellen.
2. Isoleren van menselijke neurale stamcellen uit de menselijke foetale hersenen
- Het oogsten van levensvatbaar weefsel direct na beëindiging van de foetus is van vitaal belang voor het succes van de procedure. Voor electieve procedures, kan de timing van monsters te verkrijgen zijn op voorhand zodat u de tijd na het foetaal overlijden te minimaliseren. De producten van de conceptie worden geoogst binnen 2 uur na de procedure, maar idealiter kan worden bereikt op electieve procedures binnen enkele minuten. De foetale weefsels vaak gefragmenteerd. Echter, in het algemeen een aanzienlijk deel van de hersenen intact blijft voor visuele identificatie. Beperkingen van de zwangerschapsduur (GA) wordt bepaald door de wettelijke wet, maar zijn uitgevoerd met behulp van dit protocol tussen de 18-22 weken GA.
- Foetale hersenen wordt geplaatst in een 10 ml petrischaal met ijskoude KNOCKOUT DMEM/F12 oplossing. Identificeer de verschillende delen van de cortex door anatomische oriëntatiepunten. Grenzen voor de frontale en parietooccipitalis cortex zijn gericht door de geëxtrapoleerde kruising van de centrale sulcus en Sylvian spleet. Ontleden weefsel van de frontale cortex anterior naar de centrale sulcus en langs de rand van de Sylvian spleet met chirurgische mesjes, zorg ervoor dat houden het ventrikel intact en onbeschadigd.
- Verwijder eventuele resterende bloed en de hersenvliezen van de gescheiden blok van frontale cortex. Als het monster van voldoende kwaliteit is, is het ideaal om het blok te ontleden in meerdere kleinere monsters voor verschillende doeleinden: secties (gefixeerd in 4% paraformaldehyde, PFA) en eiwit / mRNA assays (snel ingevroren in -80 ° C).
- Overdracht van de geselecteerde hersenen blok naar een centrifugebuis van 50 ml en voeg ijskoude KNOCKOUT DMEM/F12 oplossing op ongeveer 3 keer het volume van het weefsel. Voorzichtig losmaken van het weefsel door mechanische pipetteren met een 10 ml transferpipet tot alle weefsels gefragmenteerd raakt (meestal 20-30 keer), en vervolgens de cellen filter door middel van een 40 uM cel zeef (BD Falcon 352340) om een enkele of in de buurt enkele cel te krijgen opschorting.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 2000 rpm en kamertemperatuur gedurende 5 minuten, resuspendeer de cel pellet in 10 ml vers warm kweekmedium (Stem Pro NSC SFM), en tel het aantal cellen met een hemocytometer.
- Voeg 5 ml warm kweekmedium in elkaar 25 cm 2 flessen cultuur, en de overdracht 2x10 6 cellen aan elke kolf. Culturen worden onderhouden in een 37 ° C / 5% CO 2 incubator voor 1 week voor de analyse. Wijzig de helft van de medium een keer per week voor verdere culturen of experimenten.
3. Manipulaton van neurale stamcellen voor verdere karakterisering of experimenten
- Neurospheres vormen meestal in 1 tot 2 weken onder de aanbevolen cultuur voorwaarden met NSC diameter tussen 200 en 400 micrometer. Neurospheres in dit stadium kan losgekoppeld worden met 0,2 g / L EDTA aan calcium en magnesium vrij Hanks medium (Hanks) bij 37 ° C gedurende 15 minuten om enkele cellen te verkrijgen. Celsuspensie worden gesponnen bij 2000 tpm, gespoeld in verse Hanks, en opnieuw uitgeplaat in warme voedingsbodem voor subcultuur.
- Het initiëren differentiatie, kunnen worden gescheiden door cellen uitgeplaat op poly-D-lysine/laminin een beklede dekglaasjes bij een dichtheid van 1x10 5 cellen per dekglaasje (24mmX24mm). Oligodendrocyt differentiatie wordt bereikt door het handhaven van de cellen in KNOCKOUT DMEM/F12 (Invitrogen, Main, MD) +2% B27 (50X, Invitrogen, Main, MD) +10 ng / ml bFGF +100 ng / ml SHH + 10ng/ml PDGF-AA voor 2 dagen, dan schakelen naar hetzelfde medium zonder groeifactoren voor nog 5 dagen. Neuronale differentiatie wordt bereikt door het handhaven van cellen in KNOCKOUT DMEM/F12 +2% B27 (50X) gedurende 7 dagen. Astrocyten differentiatie wordt gedaan door het kweken van cellen in KNOCKOUT DMEM/F12 +1% FBS voor een week.
- Transfectie van neurale stamcellen met genen kan worden gedaan met gescheiden cellen van de voorgevormde neurospheres. Hier toonden we de neurale stamcellen getransfecteerd met EGFP-C1 door elektroporatie. De elektroporatie van EGFP-C1 construct werd gedaan met behulp van AMAXA Nucleofector Kits voor Mouse neurale stamcellen (VPG-1004) met AMAXA Nucleofector Device (Lonza AAD-1001), na instructie van het bedrijf. In het kort werden 5 ug DNA met 1 x 10 6 cellen gemengd met 100 ul transfectie medium, en na de puls elektroporatie, de cellen werden geresuspendeerd in de neurale stamcellen onderhouden medium voor verdere cultuur. De differentiatie van getransfecteerde cellen werden verwerkt met de dissociatie van neurospheres 3-4 dagen na de elektroporatie, volgens dezelfde procedures beschreven in stap 3.2.
4. Invriezen neurale stamcellen en subculturen
- Gedissocieerd celsuspensies worden gecentrifugeerd en geresuspendeerd in de vrieskou medium met een concentratie van 1x10 7 cellen / flacon / ml. Langzaam bevriezen de cellen in -20 ° C, -80 ° C dan naar vloeibare stikstof transfer voor langdurige opslag.
- De cellen zijn snel ontdooid met 37 ° C waterbad en geresuspendeerd in verwarmde DMEM/F12 +10% serum voor een wasbeurt, gecentrifugeerd om de bevriezing medium te verwijderen, en opnieuw gesuspendeerd in de verwarmde kweekmedium.
5. Representatieve resultaten:
Neurale stamcellen van een normale foetus bij 18 weken zwangerschapsduur werden gekweekt volgens de beschreven methoden en neurospheres kan worden gezien na een week met ronde, gladde randen en vrij homogene grootte (fig. 2a). Deze neurospheres kunnen worden getransfecteerd met EGFP-C1 of andere constructies en volgde onder fluorescentie microscopie (Fig.2B,). Gevestigde neurospheres werden vervolgens gedissocieerd met EDTA en vergulde als geïsoleerde cellen op gecoate dekglaasjes. Cellen onderscheiden onder de respectieve protocollen werden gefixeerd met 4% parafamaldehyde, en gekleurd met verschillende celtype specifieke markers. Multipotentiality wordt waargenomen met de expressie van markers indicatie van de neuronen (Fig2C, D, rhodamine) astrocyten (Fig2E, F, rhodamine) en oligodendrocyten (Fig2G, H, rhodamine). De cellen ondergaan elektroporatie van EGFP werden ook onderscheiden in verschillende celtypes en gekleurd met verschillende cel-specifieke markers. Multipotentiality wordt waargenomen met de expressie van markers indicatie van de neuronen (Fig3A, B, fluoroscein) astrocyten (Fig3C, rhodamine en Fig3D, fluoroscein) en oligodendrocyten (Fig3E, F, rhodamine).
Figuur 1. Schema van de experimentele procedure om neurale stamcellen te isoleren uit afgedankte menselijke foetale hersenen
Figuur 2. Ongedifferentieerde en gedifferentieerde menselijke neurale cellen propogated in vitro. (A) Neurospheres zijn opgenomen onder fase-contrast-microscopie aan te tonen gladde, ronde randen en de snelle groei na de cultuur voor meer dan 1 week. (B) Introductie van de verschillende plasmiden en constructen kunnen worden bereikt door transfectie. Drie dagen na de EGFP-C1 transfectie, meerdere cellen vertonen expressie van het groen fluorescent eiwit als gezien onder fluoroscein immunokleuring en fluorescentie microscopie. EGFP-C1 getransfecteerde neurospheres worden gescheiden en gedifferentieerde onder verschillende omstandigheden in de neuronen (C, D), astrocyten (E, F) en oligodendrocyten (G, H) en gezien onder rhodamine fluorescentie. Tegelijkertijd worden getransfecteerd EGFP positieve cellen weergegeven onder fluoroscein fluorescentie. Getransfecteerde cellen (witte pijlpunten) zijn niet te onderscheiden van ongetransfecteerde cellen (witte pijlen). De celkernen zijn gekleurd met Hoechst33342. Schaal bars zijn 200 pm voor A, 100 micrometer voor B en 25 urn voor CH.
Figuur 3. Neurospheres zonder transfectie worden gescheiden en gedifferentieerde onder verschillende omstandigheden in de neuronen (A, B, fluoroscein), astrocyten (C, rhodamine, D, fluoroscein) en oligodendrocyten (E, F, rhodamine). De celkernen zijn gekleurd met Hoechst33342. Schaal bars zijn 25 urn voor AF.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende benaderingen in de richting van cultuur verse weefsel en de productie van menselijke cellijnen. Historisch gezien is fris weefsel geoogst en onmiddellijk gekweekt om verschillende celtypes in het centrale zenuwstelsel te genereren. Deze benadering wordt echter duidelijk beperkt door het aantal monsters dat kan worden verkregen, die in het geval voor de menselijke monsters, is het meestal vrij klein. Gezien de minimale mate van manipulatie, vers gekweekte neurale cellen zorgen voor de meest betrouwb...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health: HD054347 en NS063997-01 naar VLS. Dit werk werd ook ondersteund gedeeltelijk door de Empire State Stem Cell Fonds via de New York State Department of Health Contract # C024324 naar VLS. De meningen hier zijn uitsluitend die van de auteur en geven niet noodzakelijk overeen met die van de Empire State Stem Cell van Commissarissen, de New York State Department of Health, of de staat van New York. VLS is een Doris Duke Clinical Scientist Award Developmental Ontvanger. We danken ook professor Timothy Vartanian voor zijn gave van het Anti-O1, Anti-O4 antilichamen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogus nummer | Commentaar (optioneel) |
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociatie medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Kweekmedium |
| Foetaal runderserum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks oplossing (-Ca 2 +, Mg-2 +) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociatie medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociatie medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixatie oplossing |
| bFGF | R & D | 234-FSE | Differentiatie medium |
| SHH | R & D | 1845-SH | Differentiatie medium |
| PDGF-AA | R & D | 221-AA | Differentiatie medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiatie medium |
| De muis Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell signaling | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | giften van professor Timothy Vartanian * | 01:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Geschenken van professor Timothy Vartanian * | 01:50 | |
| 40μm cel zeef | BD Falcon | 352340 |
* Timothy Vartanian, MD, PhD, afdeling Neurologie en Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, Verenigde Staten
Referenties
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo. Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).
- Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O'Dowd, D., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
- Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).
- Rajan, P., Snyder, E. Neural stem cells and their manipulation. Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).
- Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. Stem cells as in vitro models of disease. Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).
- Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors. Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).
- Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down's syndrome: a gene expression study. Lancet. 359, 310-315 (2002).
- Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia. Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).
- Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury. Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).
- Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r, Sheen, V., Steardo, L. S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells. J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).
- Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).
- Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere. J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).
- Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
