Een eenvoudige en betrouwbare methode op isolatie en de cultuur van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale corticale weefsel wordt beschreven. Culturen zijn afgeleid van bekende menselijke neurologische aandoeningen kunnen worden gebruikt voor de karakterisering van pathologische cellulaire en moleculaire processen, maar ook als een platform om de farmacologische werkzaamheid beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neurale stamcellen (NSCs) verblijven langs de ventriculaire zone neuroepithelium tijdens de ontwikkeling van de corticale plaat. Deze vroege voorouders uiteindelijk aanleiding geven tot intermediaire voorouders en later de verschillende neuronale en gliale cel subtypes dat de cerebrale cortex formulier. De capaciteit te genereren en uit te breiden menselijke NSCs (de zogenaamde neurospheres) uit afgedankte normaal foetaal weefsel een middel waarmee direct de studie van de functionele aspecten van de normale menselijke ontwikkeling van NSC 1-5. Deze aanpak kan ook worden gericht op het genereren van NSCs van bekende neurologische aandoeningen, waardoor bieden de mogelijkheid om ziekte processen die stamvader proliferatie, migratie en differentiatie 6-9 te veranderen te identificeren. Hebben we ons gericht op het identificeren van pathologische mechanismen in de menselijke het syndroom van Down NSCs die kunnen bijdragen aan de ziekte van Alzheimer versnelde fenotype 10,11. Zowel in vivo als in vitro de muis modellen kunnen repliceren de identieke repertoire van genen op menselijk chromosoom 21.
Hier gebruiken we een eenvoudige en betrouwbare methode om te isoleren het syndroom van Down NSCs van geaborteerde foetussen menselijke cortex en ze groeien in de cultuur. De methode biedt specifieke aspecten van het oogsten van de weefsel, dissectie met een beperkte anatomische oriëntatiepunten, cell sorting, beplating en de passage van de menselijke NSC. We bieden ook een aantal fundamentele protocollen voor het induceren van differentiatie van humane NSCs naar meer selectieve cel subtypes.
Protocol
1. De voorbereiding van oplossingen en materialen voor dissectie en het onderhoud van neurale stamcellen cultuur
- Bereid 100ml dissectie medium (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) van tevoren in de koelkast.
- Prepare100 ml kweekmedium (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) en houdt bij 37 ° C in een waterbad.
- Bereid cel-bevriezing medium (KNOCKOUT DMEM/F12 +10% FBS + 5% DMSO) voor lange termijn cryopreservatie van cellen.
- Indien gewenst, voor te bereiden 4% paraformaldehyde (PFA) voor weefsel fixatie.
- Steriel, geautoclaveerd pincet en scalpel bladen met handgrepen worden gebruikt voor dissectie.
- Vernietiging van een pipet....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende benaderingen in de richting van cultuur verse weefsel en de productie van menselijke cellijnen. Historisch gezien is fris weefsel geoogst en onmiddellijk gekweekt om verschillende celtypes in het centrale zenuwstelsel te genereren. Deze benadering wordt echter duidelijk beperkt door het aantal monsters dat kan worden verkregen, die in het geval voor de menselijke monsters, is het meestal vrij klein. Gezien de minimale mate van manipulatie, vers gekweekte neurale cellen zorgen voor de meest betrouwb.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health: HD054347 en NS063997-01 naar VLS. Dit werk werd ook ondersteund gedeeltelijk door de Empire State Stem Cell Fonds via de New York State Department of Health Contract # C024324 naar VLS. De meningen hier zijn uitsluitend die van de auteur en geven niet noodzakelijk overeen met die van de Empire State Stem Cell van Commissarissen, de New York State Department of Health, of de staat van New York. VLS is een Doris Duke Clinical Scientist Award Developmental Ontvanger. We danken ook professor Timothy Vartanian voor zijn gave van het Anti-O1, Anti-O4 antilichamen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogus nummer | Commentaar (optioneel) |
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociatie medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Kweekmedium |
| Foetaal runderserum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks oplossing (-Ca 2 +, Mg-2 +) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociatie medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociatie medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixatie oplossing |
| bFGF | R & D | 234-FSE | Differentiatie medium |
| SHH | R & D | 1845-SH | Differentiatie medium |
| PDGF-AA | R & D | 221-AA | Differentiatie medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiatie medium |
| De muis Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell signaling | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | giften van professor Timothy Vartanian * | 01:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Geschenken van professor Timothy Vartanian * | 01:50 | |
| 40μm cel zeef | BD Falcon | 352340 |
* Timothy Vartanian, MD, PhD, afdeling Neurologie en Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, Verenigde Staten
Referenties
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
