Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis

Summary

Stervende cellen zijn geëxtrudeerd uit epitheelweefsels door gezamenlijke contractie van naburige cellen zonder verstoring van de barrièrefunctie. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we methoden om te induceren en imago extrusie in het larvale zebravis epidermis op cellulair resolutie.

Abstract

Homeostatische onderhoud van epitheelweefsels vereist de voortdurende verwijderen van beschadigde cellen zonder verstoren barrièrefunctie. Onze studies hebben gevonden dat stervende cellen signalen sturen naar hun live buren om vormen en contract een ring van actine en myosine dat het uitgeworpen uit het epitheliale terwijl het vel sluiten eventuele lacunes die misschien hebben geresulteerd uit zijn afrit, een proces genoemd cel extrusie ^1. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we één methode om induceren en imago extrusie in de larvale zebravis epidermis. Tot visualiseren extrusie, we injecteren een rode fluorescerend eiwit gelabelde probe voor F-actine in een-cellig stadium transgene zebravis embryo uitdrukken groen fluorescerend proteïne in de epidermis en induceren apoptose door toevoeging van G418 naar larven. Vervolgens gebruiken we time-lapse imaging op een spinning disc confocale microscoop te actine dynamiek en epitheelcellen gedragingen observeren tijdens het proces van apoptotische cel extrusie. Deze aanpak laat ons toe het extrusieproces onderzoeken in live epithelia en zal een laan om ziekte toestanden veroorzaakt door het onvermogen om apoptotische cellen elimineren bestuderen.

Protocol

Basic Workflow voor de visualisatie van Actin Dynamics Tijdens Cel Extrusion in de epidermis van de ontwikkelingslanden zebravis

De epidermis van de zich ontwikkelende zebravis bestaat uit twee verschillende lagen, de oppervlaktelaag (of periderm) en een basale laag van cellen die de basale membraan ^twee contact. De cellen van de buitenste oppervlaktelaag ondergaan apoptose en worden geëlimineerd uit het weefsel door extrusie ³ (Figuur 1). Om dit te visualiseren proces in real-time, we injecteren RNA dat codeert voor rood fluorescerend eiwit gefuseerd met de calponin homologie domein van utrofine, een ....

Discussion

Het protocol hier beschreven demonstreert een eenvoudige en doeltreffende methode om het proces van extrusie visualiseren in een live epitheelweefsel. Dit type van experiment laat ons toe om te onderzoeken subtiliteiten van actine dynamiek nog niet eerder op prijs gesteld in vaste weefsel analyses, en daarom een ​​aanvulling op gemeenschappelijke immunofluorescentie methoden. We kunnen dit protocol in combinatie met chemische remmers of genetische mutanten beter te analyseren het extrusieproces en studie ziektebeelden s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam	Type	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
RNeasy Mini Kit	Reagens	Qiagen	74104
mMessage mMachine SP6 Kit	Reagens	Ambion	AM1340
Crossing Tanks	Gereedschap	Thoren Aquatic Systems
De Pipet Pump	Gereedschap	Bel Art Producten	F3789
5 ¾ Pasteur Pipet	Gereedschap	VWR	14672-608
Micro-injectie Mold	Gereedschap	Adaptieve Science Tools	I-34
100x15mm Cultuur Plate	Gereedschap	Visser	08-757-12
Flamming / Bruin micropipet Puller	Gereedschap	Sutter Instrument Company	Model P97
Borosilicaatglas capillairen met Filament	Gereedschap	Sutter Instrument Company	B1400-78-10	OD 1,0 mm, ID 0.78mm, 10cm lengte
Electrode Opslag Jar	Gereedschap	Wereld precisie-instrumenten	E210
Phenol Red	Reagens	Sigma	P0290	0,5% in DPBS
Druk-Controlled Microinjector en micromanipulator	Gereedschap	Harvard Apparatuur	PLI-100
35x10mm Cultuur Dish	Gereedschap	Cellstar	627-160
G418 (Geneticine)	Reagens	GIBCO	10131-035	50 mg / ml in dH 2 0
Dumont # 5 Forceps	Gereedschap	Fijn Science Tools	11253-20
12cm Pin Holder	Gereedschap	Fijn Science Tools	26016-12
Plaats Pins	Gereedschap	Fijn Science Tools	26007-02 en-03
Glass Bottom Cultuur Schaal met 1,5 dekglaasje	Gereedschap	MatTek	P35G-1.5-10-C
Low Melt Agarose	Reagens	Visser	BP1360-100
Tricaïne	Reagens	Sigma	A-5040
Ontleden Microscoop	Microscoop	Leica	MZ6
Ontleden Microscoop	Microscoop	Nikon	SMZ645
Fluorescerende dissectiemicroscoop	Microscoop	Olympus	S2X12
Spinning Disc confocale microscoop	Microscoop	Nikon	Eclipse Ti	Uitgerust met een Yokagawa draaiende schijf hoofd
CCD Camera	Camera	Andor	DV-885-VP	1002x1004x8 micron vierkante pixels