Karakterisering van de geïsoleerde, geventileerde en Instrumented Mouse Lung geperfuseerd met pulsatiele flow

Samenvatting

Het volgende protocol schetst het proces van isoleren, ventileren en instrumenteren muis longen stabiel of pulsatiele pulmonale vasculaire druk-flow relaties maatregel om de effecten van de bloedstroom, luchtstroom, luchtweg veranderingen en vasculaire veranderingen op rechter ventrikel afterload kwantificeren.

Samenvatting

De geïsoleerde, geventileerde en geïnstrumenteerde muis longen voorbereiding maakt stabiel en pulserende pulmonale vasculaire druk-flow relaties te meten met onafhankelijke controle over de pulmonale arteriële doorstroming, het debiet golfvorm, luchtwegdruk en linker atrium druk. Pulmonale vasculaire weerstand wordt berekend op basis van multi-point, constante druk-flow curves; pulmonale vasculaire weerstand wordt berekend op basis van pulsatiele druk-flow curves verkregen bij een bereik van frequenties. Zoals nu klinisch erkend, impedantie is een superieure maat voor rechter ventrikel afterload dan de weerstand omdat het ook de effecten van vasculaire compliance, die niet verwaarloosbaar zijn, vooral in de pulmonale circulatie. Drie belangrijke statistieken van de impedantie - de nul hertz impedantie Z _0, de karakteristieke impedantie Z _C, en de index van golf reflectie R _W - inzicht geven in distale arteriële dwarsdoorsnede beschikbaar voor flow, proximale arteriële stijfheid en de upstream-downstream impedantie mismatch, respectievelijk. Alle resultaten die in geïsoleerde, geventileerde en doorbloed longen zijn onafhankelijk van het sympathische zenuwstelsel toon, volume de status en de effecten van de anesthesie. We hebben gebruik gemaakt van deze techniek om de impact van de longembolie en chronische hypoxie op de weerstand en impedantie te kwantificeren, en om onderscheid te maken tussen sites van de actie (dat wil zeggen, proximale versus distale) van vasoactieve stoffen en ziekten met behulp van de druk afhankelijkheid van _Z-C. Bovendien, wanneer deze technieken worden gebruikt met de longen van genetisch gemanipuleerde stammen van muizen, kunnen de effecten van moleculair niveau defecten op pulmonale vasculaire structuur en functie worden bepaald.

Protocol

In dit protocol tonen we een geïsoleerde, geventileerde, doorbloed muis long preparaat dat eerder is gebruikt om de impact van de longembolie en chronische hypoxie op de pulserende pulmonale vasculaire druk-flow relaties (Tuchscherer, Webster, en Chesler, 2006 kwantificeren; Tuchscherer et al. ., 2007). In het kort worden de muis longen operatief geïsoleerd van het omliggende weefsel, geplaatst in een verwarmde kamer (IL-1; Harvard Apparatuur, Holliston, MA) en geventileerde (Ventilatoire Control Module (VCM)-R met timer teller module (TCM), Harvard Apparatuur). De long vasculatuur is geperfuseerd met verwarmd RPMI 1640 celkweekmedium met 3,5% Ficoll met behulp van een injectiepomp (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) om de constante stroom golfvormen of een hoogfrequente oscillatie pomp (Bose-Electro Force, het genereren van Eden Prairie, MN) in parallel met de spuit pomp om pulsatiele pulmonale vasculaire stroom golfvormen te creëren. Druk transducers (P75, Harvard Apparatus) meten de instantane pulmonale arteriële druk (PAP) en het linker atrium druk (LAP). Ogenblikkelijk debiet (Q) wordt gemeten met een in-line flow meter (Transonic Systems, Inc, Ithaca, NY). Pulsatiele druk-flow relaties zijn afgeleid van deze metingen, die inzicht geven in pulmonaire vasculaire fysiologie en pathologie en rechter ventrikel afterload.

1. Uitrusting:

1. Geïsoleerde long set-up met de muis ventilator
2. Data acquisitie systeem en de computer met LabVIEW-programma
3. Twee druk transducers en flowmeter voor perfusievloeistof stroom
4. Drukopnemer en debietmeter (pnemotachometer) voor de luchtwegen stroom
5. Hoge frequentie oscillatorische pomp en computer met Win Test-programma
6. Boom / zoom Microscope, lamp
7. Verwarmingsbad met een hoog vermogen pomp voor IL-1-systeem

2. De voorbereiding van de IL-1-systeem

1. Gedestilleerd water verwarmd tot 37 ° C door de verwarming bad is verspreid in het interieur van de IL-1-systeem.
2. Alle pompen, transducers en de IL-1 canule zijn verbonden via slangen schoon en alle leidingen wordt gespoeld met gedestilleerd water verwarmd tot 37 ° C. Luchtbellen, die zouden kunnen reizen in de long en oedeem veroorzaken, moeten worden verwijderd. Los van de oscillerende stroom pomp om de stroom sensor en uit de stroom sensor naar de longslagader canule worden gespoeld met 1% PBS.
3. De P75 druk transducers zijn nul door het sluiten van de klep aan de canule, het openen van de kleppen om de sfeer en drukt u de automatische nul-knop op de PLUGSYS versterker. Vervolgens wordt het ventiel naar de atmosfeer gesloten en de klep naar de canule geopend.
4. De keramische poreuze stuk in de ventilatie-route van de IL-1 systeem is bevochtigd om vocht te geven.

3. Oplossingen

1. Bereid 3,5% van het volume Ficoll-RPMI oplossing en steriele filter van de media. Het filteren van de media zorgt ervoor dat er geen grote deeltjes die onbedoeld zou kunnen embolize de long. Met behulp van steriele media vermindert ook de kans op plotselinge oedeem te ontwikkelen in de longen. Vul een 10 ml spuit met RPMI voor de operatie en een 60 ml spuit met RPMI voor elke experimentele studie. Verwarm de perfusaat in een 37 ° C waterbad.
2. Voor te bereiden 1 ml heparine 500IU/100g lichaamsgewicht van de muis (bij benadering). De heparine zout is 158IU/mg. Voor een ~ 25 g muis, mix 1,25 mg heparine zout met 1 ml PBS oplossing in een kleine microcentrifugebuis.

4. Ventileren van een muis

1. Na een intraperitoneale injectie van 150 mg pentobarbital in oplossing per kilogram in de muis, zorgen voor diepe anesthesie door het uitvoeren van een harde snufje op een poot. Als er geen reactie, de voorbereiding van de muis voor de operatie door pinnen zijn voorpoten om prikbord voor stabiliteit. Opmerking: Tijdens het experiment narcose diepte wordt gecontroleerd door zorgvuldig observeren van de dieren. De pennen in de poten en frequente incisies fungeren als schadelijke stimuli, het gebrek aan respons op, waarin wordt bevestigd dat het dier blijft een chirurgische vlak van anesthesie.
2. Spray de borst met 95% alcohol om natte beneden de vacht en het gebruik van rechte tang om de huid in de nek te grijpen. Snij een 1 cm opening in de huid met de rechte schaar.
3. Zodra de binnenkant van de hals is bloot, verwijder alle witte klierweefsel en oppervlakkige spieren, op zoek naar de slokdarm en de luchtpijp. Isoleer de slokdarm en de luchtpijp van weefsel aan beide zijden en naar achteren.
4. Steek de kleine gebogen pincet onder de luchtpijp en pak een stuk van hechting aan de andere kant. Trek de hechting onder de luchtpijp en de stropdas een losse chirurgen knoop. Niet vast of de hechting in het huwelijksbootje stappen.
5. Snij een kleine hoek "v" in de luchtpijp met een klein schaartje, doe helemaal niet doorsnijden van de luchtpijp. Verplaats de kurk boord en de muis naar de verwarmde IL-1-systeem. Met behulp van de twee stompe tang, pak de tracheale canule en de luchtpijp onder de "v". Vervolgens schuift u de tracheale canule in de Trachea door middel van de "v" opening. Draai de hechting rond luchtpijp en tracheale canule om de canule veilig binnen in de luchtpijp. In het huwelijksbootje stappen.
6. Begin ventilatie (50% inspiratie, 90 ademhalingen / min, met een diepe inademing) met lucht in de ruimte.

5. Perfuseren een Geventileerde Mouse

5.1. Toegang tot de rechter ventrikel naar heparine te injecteren

1. Spray de muis op de borst met alcohol weer opnieuw nat van de vacht. Verwijder alle van de huid op de borst boven de ribben het gebruik van rechte tang en rechte schaar. Snijd omhoog langs het borstbeen. Til de huid aan elke kant en snijd de huid na de lijn van de onderste ribben.
2. Pak de zwaardvormig proces aan de onderkant van het borstbeen met een pincet en snijd een gat in het membraan met behulp van de rechte schaar. Pak het membraan met de pincet en snijd hem uit de buurt van de ribben.
3. Pak weer het zwaardvormig proces met de pincet (linkerhand) en gebruik de bal-tip, schuine schaar te snijden op het borstbeen en door ribben, zorg dat u de longen snijden, het hart of de bloedvaten (gebruik de bal-tip op de schaar om u te begeleiden). There Will Be Blood, maar zolang het snijvlak van de schaar is tegen het borstbeen, het hart en de longen zullen niet worden gesneden.
4. Pak de ribben aan de linker kant en knip weg als een groot deel van de ribben als nodig is om het hart bloot te leggen. Injecteer langzaam de rechter ventrikel met 0,1 ml heparine oplossing. Deze stap is belangrijk voor het voorkomen van bloedstolsels in de longen, dat endotheelcellen beschadigd en zal aantasten perfusie. De heparine moet worden geïnjecteerd, terwijl het hart nog klopt.

5.2. Canule de belangrijkste longslagader

1. Knip de rest van de ribben (links en rechts) met behulp van de achterkant (afgeronde) uiteinde van de tang duw de longen uit de buurt van de rib muur. Grijpen in de longen zelf zullen beschadigen de delicate weefsel. Incidenteel contact tussen de schaar tips en het longweefsel zal ook schade veroorzaken.
2. Verplaats de microscoop op zijn plaats dan long. Knip de klier-en vetweefsel op de top van het hart. Gebruik het pincet om het weg te trekken van de slagaders en aders en snijd met de lente schaar, terwijl het weefsel wordt in spanning.
3. Met behulp van een botte set van een pincet, schep van rechts naar links van de top van hart onder linker atrium / ventrikel aan het uiteinde van het pincet te krijgen onder de aorta en de longslagader (PA). Doe dit zorgvuldig er mag niet worden verzet tegen de pincet. Met behulp van een pincet stompe verkleint de kans op per ongeluk aanprikken van de longslagader en aorta.
4. Zodra de pincet tip is onder de aorta en de PA, pak een stuk van hechtdraad en trek door. Das een losse chirurgen knoop. Niet vast of de hechting in het huwelijksbootje stappen.
5. Optioneel: gebruik de schuine schaar om de onderste helft van het lichaam te verwijderen. Snijden naar beneden door de ribben en de wervelkolom, het snijden van de aorta en de vena cava zullen een belangrijke hoeveelheid bloed te laten stromen veroorzaken - gebruik maken van een Q-tip om stelpen. Leg ze in een zak voor verwijdering.
6. Prime PA canule met 4 ml van een 10 ml spuit van RPMI. Dubbel te controleren of alle slangen vrij is van luchtbellen. Perfusie van de long met gedestilleerd water of bellen zal resulteren in oedeem.
7. Snijd een kleine inkeping in de rechter ventrikel vrije wand en plaats de PA canule, met als doel naar beneden en naar rechts. Het uiteinde van de canule moet zichtbaar zijn door de transparante wand van de PA. Infuus een kleine hoeveelheid RPMI naar uw locatie te bevestigen. Draai de hechting rond de canule, aorta en de PA en in het huwelijksbootje stappen. Merk op dat op dit punt, de aorta ook wordt afgehecht, zodat de werkelijke perfusie mag pas in het linker atrium is gecanuleerde.

5.3. Canule het linker atrium

1. Snijd een inkeping in onderste deel van de linker hartkamer en inert het linker atrium (LA) canule, met het oog naar boven. Lichte druk kan nodig zijn om de mitralisklep in deze richting te openen. In de juiste locatie, zal de canule tip glippen en veilig zijn zonder hechtdraad.

5.4. Begin perfusie

1. Handmatig trekken RPMI van de 10 ml spuit met 0,3 ml per minuut tot de RMPI is duidelijk zichtbaar in de uitstroom buis (roze-achtige kleur in contrast met de heldere PBS). Als er geen stroom in de uitstroom slangen, re-positie van de LA canule. Als er geen uitstroom kan worden verkregen met herpositionering, controleren of er een lek in de longslagader. Een lek of een scheur in de longslagader kan niet worden gerepareerd, dit is reden voor het beëindigen van de experiment.
2. Sluit een 60 ml spuit aan de PA canule door de IL-1-systeem en start 1ml/min infuus van perfusaat, controleren op lekkage en zorg ervoor dat de longen wit worden, waaruit blijkt dat RPMI is het bloed te vervangen in de longen. Perfuseren met langzame stroom voor twee minuten.

6. Meten Pulsatiele en Steady Pulmonary Pressure-Flow Relaties

1. Voor de pulsatiele flow studies, stelt u eerst de oscillerende pompzuiger verplaatsingen opde gewenste niveaus voor elke frequentie in het WinTest programma op basis van eerdere experimenten. Vanwege variabiliteit in de longen structuur en mechanica, de verplaatsingen moeten worden aangepast voor elke muis. Stel gestage stroom naar het gewenste niveau. Open de klep aan de oscillerende pomp en start de opname van gegevens vlak voor het uitvoeren van de oscillerende stroom profiel (Wintest programma). Open het bestand en plot de experimentele flow (Q) in Excel. Stel de oscillerende pompzuiger verplaatsingen bij elke frequentie (Wintest programma), zodat Q max en Q min zijn als gewenst.
2. Voor de gestage stroom studies, sluit de klep naar de oscillerende pomp. Als deze klep open blijft, de oscillerende pomp werkt als een condensator, de demping van de wijzigingen van een debiet naar de andere. Verzamelen van gegevens voor ten minste 10 seconden bij elk debiet, of totdat de PA druk niet veranderen door meer dan 5%.
3. Voor zowel pulsatiele of gestage stroom metingen, oude ventilatie bij een constante druk voor het verzamelen van gegevens. Hervatten ventilatie onmiddellijk na het verzamelen van gegevens.
4. Kijk uit voor RPMI in de luchtwegen buis, dit is het bewijs van oedeem en is reden voor het beëindigen van de experiment. Ook laat RPMI bereikt de druk in de luchtwegen of debiet omdat het schade aan de transducers.

7. Representatieve resultaten:

Vertegenwoordiger Steady Resultaten:

In de geïsoleerde long set-up de experimentator heeft de mogelijkheid om afzonderlijk te controleren niet alleen de pulmonale debiet Q, maar ook de luchtweg druk P _{de lucht} en het linker atrium druk LAP. Dit is voordelig omdat Q, P _lucht en LAP invloed op de pulmonale vaatstelsel en de daaruit voortvloeiende pulmonale arteriële druk PAP. Een ander voordeel is dat de verkregen resultaten zijn onafhankelijk van het sympathische zenuwstelsel ^een toon, volume-status, en anesthesie ^2.

PAP veranderingen veroorzaakt door trap-stap veranderingen in de Q voor vaste P _lucht en een vaste of wisselende LAP zijn weergegeven in figuur 1. Merk op dat in het geïsoleerde long voorbereiding, het LAP canule meestal is verbonden met buizen die het perfusaat stuurt in een afvalcontainer. Met deze buizen in de plaats, LAP lineair afhankelijk is van Q ten gevolge van Poiseuille stroming. Echter, de hoogte van het stopcontact en afvalcontainer handmatig worden aangepast aan een constante, niet-nul LAP verschaffen of de slang kan worden verwijderd op nul LAP die onafhankelijk is van Q. toe

Vertegenwoordiger Pulsatiele Resultaten:

Terwijl willekeurige pulsatiele flow golfvormen kunnen worden gegenereerd met dit systeem hebben we meestal het genereren van stroom van het formulier Q = 3 + 2 sin (2, onder f πt) ml / min bij een frequentie van f = 1, 2, 5, 10, 15 en 20 Hz het beoordelen van de gelineariseerde impedantie van de pulmonale vaatstelsel (Figuur 2: bovenste paneel). Uit de resulterende PAP, LAP en Q metingen zijn pulmonale vasculaire impedantie magnitude (Z) en fase (θ) berekend door eerst ontbindend een volledige cyclus van sinusvormige AP = PAP-LAP en Q op elke opgelegd sinusvormig debiet frequentie in een reeks van sinusvormige harmonischen met behulp van een Fourier-transformatie. De verhouding van de druk om te vormen tot doorstroming te transformeren levert de pulmonale vascualar impedantie, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), die magnitude Z en fase θ heeft. Ingangsimpedantie Z _0, karakteristieke impedantie _Z-C, en de index van golfreflecties R _W, worden berekend op basis van de impedantie magnitude. In het bijzonder, is Z ₀ berekend op basis van Z op de 0e harmonische (f = 0 Hz), gemiddeld over alle frequenties, Z _C wordt berekend als het gemiddelde van Z tussen de eerste minimum (5 Hz) en 20 Hz, en R _W wordt berekend als (Z _{0-Z C)} / (Z ₀ + Z _C) ^3.

Figuur 1 constante stroom golfvormen (bovenste rij) en de daaruit voortvloeiende druk. (Tweede rij: PAP, P _lucht, LAP) als een functie van de tijd met verschillende combinaties van LAP-en _P-lucht. De onderste rij toont PAP vs Q. In (A) en (B), LAP toeneemt en neemt af met Q, omdat de uitstroom buis was op zijn plaats. Deze buis is verwijderd voor de (C), zodat LAP is constant en onafhankelijk van Q. In (D) en (E) de hoogte van de uitlaat slang was handmatig ingesteld, zodat LAP is hoger, maar onafhankelijk van Q. P _lucht was, hetzij op eind-inspiratoire (A, C, D) of eind-expiratoire (B, E) druk.

Figuur 2 pulsatiele flow golfvorm Q (bovenste paneel) en de daaruit voortvloeiende druk (onder panel: PAP, LAP en P _lucht). Als een functie van de tijd. Uit deze pulserende pulmonale druk-flow relaties, kan PVZ worden berekend, wat geeft het totaal rechter ventriculaire afterload.

Discussie

Kritische stappen in de operatie

Het is van cruciaal belang dat de zorg wordt genomen bij het snijden van de ribbenkast uit de buurt van de longen. De longen moeten volledig worden vrijgemaakt en onbevangen door het omliggende weefsel tijdens de inflatie, maar niet beschadigd tijdens het proces van isolatie. Het gebruik van een plat voorwerp, zoals de achterkant van de tang kan worden gebruikt om weg te houden van de longen van de borstwand, zodat er een duidelijk pad voor de schaar te knippen....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 ml spuit	Fisher Scientific	14-829-10F
10 ml spuit	Fisher Scientific	14-823-2A
60 ml spuit	Fisher Scientific	13-689-8
RPMI met GLN 6/PK	Fisher Scientific	MT10040CV
Fles Top Filters	Fisher Scientific	09-761-57
Ficoll PM 70	Sigma-Aldrich	F2878-100g
Heparine	Sigma-Aldrich
Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Hoekige Bal Iris scharen	Fine Science Tools	14109-09
Vannas Spring Scharen - 4mm Blades	Fine Science Tools	15018-10
Fijne Iris Scharen - recht	Fine Science Tools	14106-09
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont Medical Biology Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Lauda E100 ECO-line 003	VWR international	Vergelijkbaar met Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922
IL-1 Geïsoleerd geperfundeerd muis long systeem	Harvard Apparatus	739904
Bloeddruk Transducer P75 voor PLUGSYS Module	Harvard Apparatus	730020
TS410 Flow Modules	Transonic	TS410
ME 4 PXN Precision PXN Inline Flowsensors	Transonic	ME 4 PXN
Cole-Parmer Multi-Syringe Pumps	Cole-Parmer	EW-74900-20
Nembutal 50MG/ML 20ML Vial	Amatheon