We beschrijven fotobleken methoden, met inbegrip Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) en fluorescentie Loss In Photobleaching (FLIP) om chromatine eiwit dynamiek monitor in embryonale stamcellen (ES) cellen. Chromatine eiwit dynamiek, die wordt beschouwd als een van de middelen om chromatine plasticiteit bestuderen, wordt versterkt in de pluripotente cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fotobleken Analyses (FRAP & FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) en fluorescentie Loss In Photobleaching (FLIP) kan de studie van proteïne dynamiek in levende cellen met een goede ruimtelijke en temporele resolutie. Hier beschrijven we hoe u FRAP en Flip testen van chromatine eiwitten, waaronder H1 en HP1, in de muis embryonale stamcellen (ES)-cellen uit te voeren. In een FRAP experiment worden de cellen getransfecteerd, ofwel tijdelijk of stabiel, met een eiwit van interesse gefuseerd met het groen fluorescerend eiwit (GFP) of derivaten daarvan (YFP, GVB, Cherry, etc.). In de getransfecteerde, fluorescerende cellen, een intense gerichte laserstraal bleekmiddelen een relatief klein gebied van de interest (ROI). De laser golflengte wordt gekozen op basis van het fluorescerende eiwit dat wordt gebruikt voor de fusie. Het laserlicht onomkeerbaar het fluorescerende signaal van moleculen bleekmiddelen in de ROI en, direct na het bleken, het herstel van het fluorescerende signaal in het gebleekte gebied - gemedieerd door de vervanging van de gebleekte moleculen met de ongebleekte moleculen - is gecontroleerd met behulp van time lapse imaging. De gegenereerde fluorescentie herstel curves geven informatie over de mobiliteit van het eiwit. Als de fluorescerende moleculen zijn onbeweeglijk, zal er geen fluorescentie herstel worden waargenomen. In een complementaire aanpak, Fluorescentie Verlies in Photobleaching (FLIP), de laserstraal bleekt op dezelfde plek herhaaldelijk en de intensiteit van het signaal is elders in de fluorescerende cel gemeten. FLIP experimenten dan ook te meten signaal verval in plaats van fluorescentie herstel en zijn nuttig om eiwit mobiliteit en eiwitten pendelt tussen cellulaire compartimenten te bepalen. Transient binding is een gemeenschappelijke eigenschap van chromatine-geassocieerde eiwitten. Hoewel het belangrijkste deel van elk chromatine eiwit is gebonden aan chromatine op elk gewenst moment bij steady state, de binding is van voorbijgaande aard en de meeste chromatine-eiwitten hebben een hoge omzet van chromatine, met een verblijftijd in de orde van seconden. Deze eigenschappen zijn cruciaal voor het genereren van hoge plasticiteit in het genoom van meningsuiting 1. Fotobleken experimenten zijn dan ook bijzonder nuttig om chromatine plasticiteit met behulp van GFP-fusie-versies van chromatine structurele eiwitten, vooral in ES-cellen, te bepalen waar de dynamische uitwisseling van chromatine-eiwitten (waaronder heterochromatine eiwit 1 (HP1), linker histon H1 en kern histonen) is hoger dan in de gedifferentieerde cellen 2,3.
Protocol
1. Beplating van de ES-cellen
T = 0 uur
MEF plating
- De vacht van de live-imaging 8-goed μ-Slides (ibidi, München, Duitsland), met gelatine of in chambered dekglaasjes (Lab-Tek, Rochester, NY) of in glazen bodem cultuur gerechten (MatTek, Ashland, MA). Laat gedurende 5-30 min en zuig weg vrij gelatine.
- Zaad 22.000 MEF / putje in 250 ui totale volume van DMEM [aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS)]. Laat cellen om te groeien in een weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2).
T = 6 uur
ES-cel plating
- Aspireren DMEM.
- Zaad elke MEF goed bedekt met 15.000 R1 cellen / putje in 250 ui totaal volume van de ES-cel-media [aangevuld met 10% ESC-grade foetaal bovine serum (FBS), 1 mM natrium pyruvaat, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 0,1 mM β- mercaptoethanol, en 1000 U / ml leukemie remmende factor (LIF)], tot 30% tot 50% confluentie het verkrijgen van de volgende dag.
2. Transfecteren de ES-cellen
T = 24 uur
Transiënte transfectie
- Vervang de ES-cel media met 250 ul / putje van verse ES-cel media.
- In een 1,5-ml steriele reageerbuis, voeg 100 ul serum-vrije media [Opti-MEM (Gibco)], dan is 10 ul Transit-LT1 transfectiereagens (Mirus) toe te voegen direct in het serum vrije media. Meng door zachtjes te pipetteren en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 50-20 minuten.
- Voeg 1,5 microgram GFP fusie plasmide DNA (H1E, H1o of HP1) om de verdunde transit-LT1 reagens. Meng door zachtjes te pipetteren en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15-30 minuten.
- Voeg 13,5 ul / putje van de transfectie mengsel. Swirl de 8-goed μ-Dia's om zelfs verspreiding zorgen. Na 24 uur vervanging van de oude ES-cel media met 250 ul vers ES-cel media.
3. Het uitvoeren van FRAP en FLIP
T = 48-72 uur
- Het experiment kan worden uitgevoerd op elke confocale laser scanning microscoop (CLSM), maar omdat in een normale FRAP / FLIP experiment, vele opeenvolgende beelden worden verkregen, is het raadzaam om een spinning-disk confocale microscoop, die overname snelheid maakt het gebruik en zorgt ervoor dat er geen ongewenste sample bleken zal optreden na de eerste opzettelijke bleken evenement. Hier raden wij het gebruik van de Revolutie draaiende schijf confocale systeem (www.Andor.com), met de Yokogawa CSU-X draaiende schijf hoofd. Dit systeem heeft de dubbele capaciteit om photobleach behulp van een gespecialiseerde FRAPPA module met een punt scanning systeem, en snel schakelen het licht terug naar beelden met behulp van de draaiende schijf te verzamelen. De drie meest voorkomende fluorescerende eiwitten die gebruikt worden voor fotobleken experimenten GFP, YFP en Cherry. Als GFP of YFP worden gebruikt, is een ~ 488 nm laser nodig. Voor Cherry, gebruik dan een ~ 560 nm laser. In alle gevallen adviseren wij het gebruik van solid state lasers. Met een geautomatiseerd stadium is nuttig maar niet vereist. Omdat levende cellen worden afgebeeld, is het essentieel om een milieu-kamer gebruiken (we gebruiken een van LIS, Zwitserland), controleren zuurstof, vocht, CO 2 en temperatuur. FRAP is uitgevoerd met behulp van een maximale laser intensiteit, terwijl beeldvorming wordt gedaan met de minimaal benodigde laservermogen (meestal in het gebied van 10%, bij fluorescentie-niveau voldoende is).
Let op de cellen met tl-licht van de juiste golflengte en selecteert u een cel die GFP met behulp van een 60X olie-immersie lens. Let op de juiste subcellulaire distributie. Af en toe, als expressie niveaus te hoog zijn, kan het eiwit van de lokalisatie 'spill' naar andere compartimenten, zoals de nucleolus. Dergelijke cellen mag niet worden geselecteerd. - Nu een imaging protocol: het verzamelen van 3-5 frames voor de photobleaching, dan photobleach op euchromatin of heterochromatine (gezien als gecondenseerde GFP foci) en het verzamelen van 90 tot 120 frames na de photobleach, met 250 tot 1000 ms intervallen: H1E-GFP, 1000 ms, H1o en HP1-GFP, 250 ms (interval tijd verandert al naar gelang het eiwit dynamiek, waar zeer dynamische eiwitten nodig hebben korter interval tijd). We normaal gesproken gebruik van 80-100% laser intensiteit voor fotobleken met een laserpuls van 20-40 μseconds (1-2 herhalingen), maar deze cijfers kunnen veranderen, afhankelijk van de geanalyseerde eiwit en de expressie niveaus. Wanneer photobleaching gepast is, moet u zich aan een "zwart gat" in uw GFP fluorescentie. Het zwarte gat is geleidelijk weer gevuld met fluorescentie na herstel. Hoewel de draaiende schijf kan krijgen voor ongeveer 60 beelden per seconde (met goede fluorescentie-intensiteit en bij het inzoomen op een enkele cel), we raden het gebruik van het systeem op zulke hoge snelheden als gevolg van een lage beeldkwaliteit en mogelijk verhoogde fototoxiciteit.
- Voor een FLIP experiment, het opzetten van een andere imaging protocol: het verzamelen van 3-5 frames voor het bleken, dan start herhaald bleken op dezelfde plek terwijl het verzamelen van beelden. Voor H1E-GFP, bleekmiddel om de 5 seconden, voor H1o-GFP, bleekmiddel om de 2 sec, en voor het HP1-GFP bleekmiddel om de 1 sec. Bleach eend herhaaldelijk te verzamelen opnamen over het gehele experiment.
- Voor beide technieken, herhaal het proces op 20 tot 30 cellen. Voor statistische doeleinden, herhaal experiment 3 keer of meer, bij voorkeur op verschillende dagen. In homogene bevolking en de juiste instellingen, de standaarddeviatie is meestal laag (<5%).
Voor zowel FRAP en Flip, de grootte en vorm van de gebleekte regio beïnvloedt het herstel dynamiek en moet constant blijven binnen een experiment. Ook wanneer twee cellen worden vergeleken, moeten identieke protocollen worden gebruikt en de cellen moeten opeenvolgend worden geanalyseerd op dezelfde dag als power laser-en andere voorwaarden kan fluctueren en kan de uitkomst van het experiment beïnvloeden.
4. FRAP en FLIP Data Analysis
- In alle FRAP frames verzameld, het meten van de fluorescentie-intensiteit in de ROI (ROI b = gebleekt gebied), de achtergrond gebied (ROI bg), en de niet-gebleekte nucleair gebied (ROI nb) als een functie van de tijd voor en na het bleken. Wanneer de gebleekte regio te verwaarlozen is de hele kern kan worden geselecteerd voor normalisering doeleinden.
- Voor elk tijdstip, normaliseren van gegevens volgens de formule: (ROI b - ROI BG) / (ROI nb - ROI BG) / (pbROI b - pbROI BG) / (pbROI nb - pbROI bg), pb geeft pre-gebleekt. Voor pre-bleach beelden die u moet krijgen een waarde van ongeveer 1. Het eerste beeld na het bleekmiddel geeft de Bleach diepte. Trek de waarde van een voor de actuele Bleach Depth-waarde. Herhaal dit voor elke cel en 20-30 cellen van elk experiment.
- In alle verzamelde FLIP frames, het meten van de fluorescentie-intensiteit in de niet-gebleekte nucleair gebied, en de achtergrond gebied (ROI nb = niet-gebleekte gebied, ROI bg = achtergrond). Berekening van de FLIP-gegevens is vergelijkbaar met een FRAP curve, moet alleen de geanalyseerde ROI (ROI nb) anders zijn dan de werkelijke gebleekte regio, die niet wordt gebruikt voor de berekening: (ROI nb - ROI BG) / (pbROI nb - pbROI BG) . Het is ook mogelijk om een naburige cel (ROI n = buurman cel) te gebruiken voor normalisatie doeleinden: (ROI nb - ROI BG) / (ROI n - ROI BG) / (pbROI nb - pbROI BG) / (pbROI n - pbROI bg ).
Na het verzamelen van gegevens, is het mogelijk passen bij de experimentele gegevens op een computer simulatie. Dit laat berekenen, met een goede nabijheid, de mobiele fractie, de onbeweeglijke fractie en de half-maximum. We zullen hier niet ingaan op de wiskundige en statistische aspecten van FRAP analyses en verwijzen de lezer naar andere uitstekende publicaties 4-9. Het bleekmiddel diepte verwijst naar de afstand (op de y-as) tussen de pre-bleach (100%) signaal en het eerste plaatje na bleekwater, de mobiele fractie verwijst naar de afstand (op de y-as) tussen het bleekmiddel diepte en de herstelde signaal wanneer de kinetiek een plateau bereikt, en de immobiele fractie verwijst naar de afstand (op de y-as) tussen de herstelde signaal en de pre-bleach (100%) signaal (zie figuren 1B en 2B). Afgezien van deze analyse, zijn er goede wiskundige modellen om de data te passen. Voor een enkele exponent, de vergelijking
waar t is tijd, A is de mobiele fractie, 1-A is de immobiele fractie en k off is de dissociatieconstante, kan gebruikt worden om de gegevens te passen, en een directe schatting van de off snelheid van binding (k off) kan zijn verkregen, alsmede voor de parameter A, die gebruikt kan worden om de vereniging te berekenen.
5. Representatieve resultaten:
Figuur 1. A en B tonen vertegenwoordiger FRAP rondingen van HP1 (links), H1o (midden) en H1E (rechts) in R1 ES-cellen. Voor de eenvoud en duidelijkheid Figuur 1A toont de ruwe data van een enkele cel voordat er een normalisering en berekening. De gele curve komt overeen met de gebleekte regio, de paarse curve komt overeen met de niet-gebleekte nucleair gebied (wanneer de gebleekte regio te verwaarlozen is de hele kern kan worden geselecteerd voor normalisatie doeleinden), en de rode lijn komt overeen met de achtergrond fluorescentie, dat is minimaal in dit geval. Verticale pijl geeft het bleekmiddel tijd. Genormaliseerd en gemiddelde gegevens is weergegeven in figuur 1B. Let op de trager herstel van de H1 (blauw) in vergelijking met HP1 (rood). Ook de H1E variant (donkerblauw) is langzamer dan de H1o variant (lichtblauw). Mobiele en immobiele fracties en Bleach diepte zijn geïndiceerd voor HP1.
Figuur 2. A en B tonen vertegenwoordiger FRAP curves vergelijken euchromatin (links) met heterochromatine (rechts) van HP1 in R1 ES-cellen. Net als in Figuur 1, Figuur 2A ruwe data van een enkele cel shows, gele curve komt overeen met de gebleekte regio, paarse curve komt overeen met de niet-gebleekte nucleair gebied, en de rode lijn komt overeen met de achtergrond fluorescentie. Verticale pijl geeft het bleekmiddel tijd. Genormaliseerd en gemiddelde gegevens is weergegeven in figuur 2B. Let op de trager herstel van heterochromatine (donker rood) in vergelijking met euchromatin (licht rood). Mobiele en immobiele fracties en Bleach diepte zijn geïndiceerd voor euchromatin.
Figuur 3.. Een typische FLIP experiment van H1o R1 ES-cellen is weergegeven in figuur 3A (rauw, niet-genormaliseerde data) en B (genormaliseerd en gemiddeld gegevens). In dit experiment de paarse curve komt overeen met de niet-gebleekte nucleair gebied, de groene lijn komt overeen met een naburige celkern en de rode lijn komt overeen met de achtergrond fluorescentie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Tegenstelling tot de meeste beschikbare technieken, die gezuiverd chromatine betrekken van cel populaties of vaste cellen, FRAP experimenten volgen veranderingen in het chromatine eiwit dynamiek in levende cellen. We vonden chromatine eiwit dynamiek om een goede indicator voor het chromatine plasticiteit zijn. Echter, omdat het vereist het fuseren van de gen van belang met GFP, kan de toevoeging van de tl-tag interfereren met de functie van het eiwit. Dus, voordat u verdergaat met FRAP, moet het fusie-eiwit rigoureus ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken de leden van de Meshorer lab, in het bijzonder Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout en Alva Biran, voor kritische opmerkingen en voor trouble-shooting fotobleken experimenten op een dagelijkse basis. EM is een Joseph H. en Belle R. Braun Senior Lecturer in Life Sciences en wordt ondersteund door de Israel Science Foundation (ISF 943/09), het Israëlische ministerie van Volksgezondheid (6007) de Europese Unie (IRG-206872 en 238176), de Israëlische Cancer Research Foundation, de interne Applicatieve Medical Subsidies van de Hebreeuwse Universiteit en het Israel Institute Psychobiologie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogus nummer | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| Gelatine | Merck | 1,04078 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 | |
| Transit-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| 8-well μ-slides | ibidi | 80826 |
Referenties
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E. Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. Girard, L. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge. (2008).
- Meshorer, E. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , Cold Spring Harbor Press. (2009).
- Dundr, M., Misteli, T. Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).
- Ellenberg, J. Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).
- Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus. Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).
- Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know. Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).
- Poser, I. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Sigal, A. Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells. Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).
- Cohen, A. A. Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug. Science. 322, 1511-1516 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
