Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Samenvatting

In deze video, beschrijven we een methode voor het live-cell imaging van asymmetrisch te verdelen zintuig progenitor cellen en epidermale cellen in intacte Drosophila Poppen

Samenvatting

Sinds de ontdekking van Green Fluorescent Protein (GFP), is er sprake van een revolutionaire verandering in het gebruik van live-cell imaging als een instrument voor het begrijpen van fundamentele biologische mechanismen. Opvallende vooruitgang is vooral duidelijk in Drosophila, waarvan een uitgebreide toolkit van mutanten en transgene lijnen biedt een handige model om evolutionair geconserveerd-ontwikkelings-en celbiologische mechanismen te bestuderen. Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen van de mechanismen die de controle lot van de cel specificatie in de volwassen perifere zenuwstelsel (PNS) in Drosophila. Haren die betrekking hebben op de kop, thorax, buik, benen en vleugels van de volwassen vlieg individuele mechanosensorische organen, en zijn bestudeerd als een modelsysteem voor het begrijpen van de mechanismen van de Notch-afhankelijke cel beslissingen over het lot. Zintuig precursor (SOP) cellen van het microchaetes (of kleine haren), zijn verdeeld over het epitheel van het popstadium thorax, en zijn opgegeven tijdens de eerste 12 uur na het begin van de verpopping. Na de specificatie van de SOP cellen beginnen te verdelen, scheiding van de lot van de cel determinant Numb aan een dochter cel tijdens de mitose. Gevoelloos functioneert als een cel-autonome remmer van de Notch signaalweg.

Hier tonen we een methode om eiwit dynamiek volgen in SOP cel en zijn nakomelingen in de intacte popstadium thorax met een combinatie van weefsel-specifieke Gal4 drivers en GFP-gelabelde fusie-eiwitten ^1,2. Deze techniek heeft het voordeel ten opzichte van vaste weefsel of gekweekte explantaten omdat het ons toelaat het volgen van de gehele ontwikkeling van een orgaan van specificatie van de neurale voorloper van de groei en terminale differentiatie van het orgel. We kunnen dus direct correleren veranderingen in cel gedrag op veranderingen in de terminale differentiatie. Bovendien kunnen we de live-beeldvormende techniek te combineren met mozaïek analyse met een repressible cel marker (MARCM) systeem om de dynamiek van de gelabelde eiwitten te beoordelen in mitotische SOP onder mutant of wildtype omstandigheden. Met behulp van deze techniek, hebben wij en anderen geopenbaard nieuwe inzichten in de regulatie van asymmetrische celdeling en de controle van Notch signalering activering in SOP cellen (voorbeelden zijn referenties ^{1-6,7, 8).}

Protocol

Vereiste Materialen: Dissection stereo-microscoop, dubbelzijdig tape, standaard microscoopglaasje en dekglaasje, dissectie pincet (maat 5 of 5.5), zachte borstel, siliconen vacuüm vet, 5cc spuit, Whatman papier, confocale of epifluorescentiemicroscoop met digitale camera en beeld acquisitie software.

1. Popstadium Dissection

1. Stel een kruis (met de juiste combinatie van Gal4 lijn en een GFP gelabelde fusie-eiwit onder UAS controle) of plaats vliegt uit een voorraad die u wenst om de afbeelding in verschillende verse flesjes bij 25 ° C.
2. SOP-cellen over het algemeen beginnen te verspreiden op het popstadium thorax op achttien uur na het begin van de verpopping, we daarom selecteert u "wit" poppen uit de betreffende vliegen voorraad of over te steken. Witte poppen hebben het popstadium morfologie, maar hebben een ongepigmenteerde pupal geval is, wat aangeeft dat die pupariated binnen het uur.
3. Wacht ongeveer 18 uur.
4. Leg een stuk dubbelzijdig plakband op de dia. Verzamel poppen en houden het popstadium zaak naar de dubbelzijdige tape met de buikzijde naar beneden. Pak de rand van het operculum (het ronde luik op de voorste dorsale punt van het popstadium geval) met de tang
5. Til, te verwijderen, en gooi het operculum, onthullen het hoofd van de onvolwassen vliegen.
6. Gebruik de tang om te beginnen met scheuren langs de zijkant van het popstadium geval. Til de buik van het popstadium zaak uit de gescheurde kant en breng deze over naar de andere kant, ofwel volledig te verwijderen of bevestig het aan de tape, het openbaren van de thorax en de voorste deel van de buik. ( Opmerking: Er is een kloof tussen de ontwikkeling van vliegen en het popstadium geval. Wees niet te doorboren de vliegen als de wand van de behuizing is gescheurd.)
7. Begin snijden langs dezelfde kant van het popstadium geval naar de achterkant einde. Nogmaals, wees niet te doorboren de vlieg. Trek aan de pop-zaak naar de andere kant van de vlieg en druk op de dubbelzijdige tape. De buik moet nu volledig worden vrijgemaakt. Plaats de zachte borstel direct onder het hoofd van de vlieg. Zodra de vlieg vast aan de borstel en vrij van het popstadium geval gebruikt u de borstel om til-the-fly het glaasje af.

2. Popstadium Montage

Na dissectie, zijn poppen vervolgens gemonteerd tussen schuiven en dekglaasje:

8. Geïsoleerde poppen verwijderd zaak kan dan worden geplaatst op het midden van een glasplaatje dorsale kant naar boven.
9. Maak een vierkant frame van Whatman papier 18X18mm het verlaten van een 10x10 mm opening in het midden. Dompel het papier in water tot verzadiging. Plaats rond de poppen.
10. Met behulp van een 5 cc injectiespuit gevuld met siliconen vacuüm vet, breng dan een uniforme laag van vet rond de Whatman frame. Het vet laag moet passen binnen het dekglaasje (figuur 1) en de dikte moet alleen een beetje groter dan de popstadium diameter.
11. Een kleine druppel water (1 pl) Plaats in het midden van een 22x22 mm dekglaasje en het dekglaasje op de bovenstaande bereiding plaats van dien aard dat de kleine waterdruppel contact komt met het oppervlak dat u wilt dat het beeld, notum in dit geval). Comprimeer voorzichtig om een ​​volledige afsluiting van vacuüm vet en vlakke contact oppervlak tussen de dekglaasje en popstadium cuticula te vormen.
12. Voorbereiding kan vervolgens worden afgebeeld op de omgekeerde of rechtop microcopes, met behulp van epifluorecence, confocale (laser scanning of een draaiende schijf type) of twee-foton confocale. Als je voorzichtig bent, kunnen volwassen vliegen worden hersteld na enkele dagen.

3. Representatieve resultaten:

Met behulp van een SOP-specifieke Gal4 lijn ( Neuralized-Gal4) gekruist met GFP gelabelde eiwitten om de mitotische spindel (tubuline of Tau-GFP) of histon-eiwitten (H2B-GFP) label, kan men observeren divisie vlak van SOP celdeling, de lengte van de celcyclus, of het aantal mitotische divisies door gebruik te maken time lapse imaging ⁹. Andere fusie-eiwitten die de cellulaire organellen zoals Rab-GTPases te richten op de verschillende compartimenten endocytische mark (Rab5-GFP voor vroege endosomen of Rab11 GFP voor recycling endosomen) of eiwitten belangrijk in Notch signalisatie regelgeving (Numb-, Partner van Numb-GFP, of Sanpodo -GFP) kan opleveren belangrijke inzichten in de mechanismen van asymmetrische celdeling en membraaneiwit mensenhandel ^2,3,7,10,11.

Figuur 1: popstadium dissectie en montage. A. Stap-voor-stap beelden tonen de procedure om het popstadium geval te verwijderen en intact poppen voor te bereiden op de montage en live cell imaging. Poppen worden verwijderd uit de flacon en geplaatst, dorsale kant naar boven, op dubbele plakband bevestigd aan een glasplaatje. Eerste kolom, het verwijderen van de operculum en scheuren langs de zijkant van het popstadium geval. Tweede kolom, het verwijderen van pupal zaak uit thoracale en abdominale regio. De gratis pop wordt dan opgetild uit het popstadium geval met een zachte borstel. B. Montage poppen tussen de glijbaan en dekglaasje aan. Pupa is geplaatst rug-kant naar boven op het glasplaatje, omgeven door een vochtig frame van Whatman papier. Een continue kraal van siliconen vacuüm vet geëxtrudeerd uit een 5cc spuit functies toe aan de dia-dekglaasje combinatie van afdichting, de bescherming van de pop van uitdroging en verheffen het dekglaasje, zodat het rust zachtjes op de popstadium thorax. Een kleine druppel water (1 pi) op ​​het grensvlak tussen het dekglaasje en de thorax cuticula verbetert de beeldkwaliteit aanzienlijk bij het gebruik van immersie doelstellingen (water of olie). Klik hier om een ​​grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Representatieve beelden van levende cellen en SOP gedifferentieerde externe zintuigen gemaakt met behulp van onze popstadium dissectie en montage procedure. Een. Beelden uit een tijdreeks van een mitotische SOP cel die actine-GFP fusie-eiwit onder controle van Neuralized- Gal4 ( Neur- Gal4/UAS-actin-GFP), let corticale accumulatie van actine aan de splitsing groef (1 image / elke 2 minuten). B. SOP dochtercellen co-expressie Partner van Numb-RFP (rood) en Rab5-GFP gedreven door Neuralized- Gal4, let op de asymmetrische verdeling van de Pon-RFP in een dochter cel (pIIb) en de verdeling van de vroege endosomen in beide dochtercellen. C. Volume rendering van een z-serie gemaakt van een gedifferentieerde externe zintuigen in een laat popstadium. Cuticle structuren, zoals mechnosensory borstels en de epidermale haren onthuld door nagelriem autofluorescentie (rood). Daarnaast hebben we het gebruikte MARCM systeem om Lgl-GFP (aangedreven door uitdrukkelijke Neuralized- Gal4) in een subset van zintuig voorloper cellen (groen). (Deze beelden werden alle verworven met een Nikon C1 scanning confocale microscoop met behulp van een 60X 1,45 NA doel)

Discussie

In deze video, illustreren we een techniek voor het isoleren en montage Drosophila Pupaefor live cell imaging van de SOP cellen op het popstadium notum. Verwijdering van poppen uit de popstadium geval vereist een vaste hand, geschikte instrumenten, en wat oefening, maar is gemakkelijk te leren. Het is belangrijk dat enscenering van poppen nauwkeurig worden gedaan, om het relatieve gemak van dissectie te waarborgen en het vangen van de proliferatie fase van de SOP ontwikkeling. Eenmaal gemonteerd, zal poppen blijven ontwikkelen tussen de dia's en dekglaasje, en in de meeste gevallen zal de pharate volwassen stadium te bereiken, en uiteindelijk Eclose. In onze ervaring, kunnen cellen worden afgebeeld in de loop van enkele uren. Deze montage techniek is niet beperkt tot het observeren van PNS voorloper cellen op het popstadium thorax, maar kan gebruikt worden om alle cellen die dicht bij de nagelriem oppervlak en toegankelijk voor de microscoop objectief te visualiseren, (let op dat de waarnemingen zijn gedaan in een stadium waarin het popstadium zaak kan verwijderen zonder het doden van de pop, meestal ongeveer 10 tot 14 uur na puparium vorming). We hebben met succes gevisualiseerd junctionele eiwitten, cytoskeleteiwitten en blaasje handel toezichthouders in popstadium epitheliale cellen (ongepubliceerde gegevens).

De pop-montage techniek heeft ook konden we een methode te ontwikkelen om de afbeelding cuticulair structuren in een vergevorderd stadium poppen met behulp van de scanning confocale microscoop, om de morfologie van mechanosensorische borstels en de epidermale haren met behulp van de intrinsieke autofluorescentie van de cuticula te visualiseren. Deze beelden lijken op scanning electronenmicroscoop van vliegen cuticula, maar kan worden verkregen van levende dieren, en stellen ons in staat om gelijktijdig te visualiseren cuticulair morfologie en de expressie van GFP-fluorescentie ^6,7,12.

Materialen

• Scotch dubbele plakband
• Glasplaatje
• 18mmX18mm dekglaasje
• Pincet
• Whatman papier
• Dow Corning Silicone vacuüm vet
• 5 ml spuit
• Pipetter
• Confocale of epifluorescentiemicroscoop