Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Samenvatting

Optische resolutie fotoakoestische microscopie (OR-PAM) is een opkomende technologie die in staat van beeldvorming optische absorptie contrasten In vivo Met cellulaire resolutie en gevoeligheid. Hier bieden wij een gevisualiseerd instructie op de experimentele protocollen van OR-PAM, met inbegrip van de systeemconfiguratie, systeem uitlijning, typisch In vivo Experimentele procedures, en functionele beeldvorming regelingen.

Samenvatting

Optische microscopie, waardevolle inzichten op cellulair en organellen niveaus, is alom erkend als een mogelijk biomedische technologie. Als de pijlers van de in vivo drie-dimensionale (3-D) optische microscopie, single-/multi-photon fluorescentie microscopie en optische coherentie tomografie (OCT) hebben aangetoond hun buitengewone gevoeligheid voor fluorescentie-en optische verstrooiing contrasten, respectievelijk. Echter, de optische absorptie contrast van biologische weefsels, die essentiële fysiologische / pathologische informatie codeert, nog niet toetsbaar.

De opkomst van biomedische photoacoustics heeft geleid tot een nieuwe tak van optische microscopie optische resolutie fotoakoestische microscopie (OR-PAM) ^1, waar de optische bestraling is gericht op de diffractielimiet om cellulaire ¹ of zelfs ² subcellulaire niveau laterale resolutie te bereiken. Als een waardevolle aanvulling op de bestaande optische microscopie-technologieën, OR-PAM brengt in ten minste twee nieuwigheden. Eerst en vooral, OR-PAM detecteert optische absorptie in contrast met buitengewone gevoeligheid (dat wil zeggen 100%). De combinatie van OR-PAM met fluorescentie microscopie ³ of met optische-verstrooiing op basis van ⁰⁴ oktober (of met beide) biedt uitgebreide optische eigenschappen van biologische weefsels. Ten tweede, OR-PAM codeert optische absorptie in akoestische golven, in tegenstelling tot de pure optische processen in fluorescentie microscopie en oktober, en biedt achtergrond-free detectie. De akoestische detectie in OR-PAM mitigeert de effecten van optische verstrooiing van signaal degradatie en natuurlijk elimineert mogelijke storingen (dat wil zeggen, CROSSTALKS) tussen excitatie en detectie, dat is een veel voorkomend probleem bij fluorescentie microscopie te wijten aan de overlap tussen de excitatie-en fluorescentie spectra.

Uniek voor optische absorptie beeldvorming, heeft OR-PAM aangetoond breed biomedische toepassingen sinds de uitvinding, met inbegrip van maar niet beperkt tot, neurologie ^{5, 6,} oogheelkunde ^{7, 8,} vasculaire biologie ^{9, 10} en dermatologie. In deze video, leren wij de systeemconfiguratie en de uitlijning van de OR-PAM evenals de experimentele procedures voor in-vivo functionele microvasculaire beeldvorming.

Protocol

1. Systeemconfiguratie

1. Optische straling
   1. Optische bestraling bron: een diode-gepompte solid-state gepulste laser (INNOSLAB, Edgewave) en een kleurstof laser (CBR-D, Sirah).
   2. De output laserstraal (puls breedte: 7 ns) is gericht op een condensor lens (LA1131, Thorlabs) om door een 50-um pinhole (P50C, Thorlabs).
   3. De pinhole is iets weg geplaatst van het brandpunt van de condensor lens om de pinhole diameter met de fundamentele-mode bundel diameter voor effectieve ruimtelijke filtering wedstrijd.
   4. De gefilterde bundel wordt verzwakt door een neutrale dichtheid filter (NDC-50C-2M, Thorlabs) en vervolgens gekoppeld in een single-mode glasvezel (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
   5. De vezel uitgang vult de achterkant diafragma van een microscoop doelstelling (RMS4X, Thorlabs) te komen tot een diffractie-beperkte optische focus van ~ 2,6 micrometer bij een golflengte van 570 nm.
2. Ultrasoon detectie
   1. Ultrasone transducer: 50-MHz centrale frequentie (V214-BB-RM, Olympus-NDT).
   2. De ultrasone transducer is aangesloten op een home-made akoestisch-optische beam combiner ¹¹ voor ultrasone detectie, die coaxiaal is uitgelijnd met de diffractie-beperkte optische bestraling.
   3. Een bolvormige holte is de grond uit de bodem van de combiner om een ​​akoestische lens te produceren. Dit akoestische lens heeft een numerieke apertuur van 0,5 in water en geeft een akoestisch middelpunt diameter van 43 urn op de 50-MHz-centrale frequentie.
   4. De optische en akoestische foci zijn confocally afgestemd op de detectie gevoeligheid te maximaliseren.
3. Akoestische koppeling
   1. Droog ultrasone koppeling wordt gebruikt om te voorkomen dat onderdompelen proefdieren in water, dat gebruikt werd in het begin van fotoakoestische imaging systemen ^12.
   2. Een imaging-venster wordt geopend op de bodem van een petrischaal (9 cm in diameter) en wordt afgesloten met een ultrasoon-en optisch transparant polyethyleen membraan.
   3. Ultrasone gel (Clear Image, SonoTech) tussen de polyethyleen membraan en het object dat moet worden afgebeeld koppels de gegenereerde fotoakoestische golf van het object naar de petrischaal, en gedeïoniseerd water in de petrischaal verder koppels de golf aan de ondergedompelde OR-PAM belichtingskop .
4. Elektronica
   1. De fotoakoestische signaal gedetecteerd door de ultrasone transducer wordt versterkt door twee versterkers in cascade (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
   2. Het versterkte signaal wordt gedigitaliseerd door een 14-bit data-acquisitie (DAQ) board (CompuScope 14.200, Gage Toegepaste Wetenschappen) bij een sampling rate van 200 MS / s.
5. Scannen regeling
   1. Twee-dimensionale (2-D) raster scannen van de OR-PAM belichtingskop langs de horizontale (xy) vlak wordt gecontroleerd door een personal computer, die zowel de DAQ raad van bestuur en de pomp laser triggers. De trigger-signaal wordt gesynchroniseerd met de klok-out signaal van de DAQ bord.
   2. De snelle as van de 2-D scanner wordt gedefinieerd als de richting van de cross-sectionele scan (B-scan).
   3. Een reeks van B-scan beelden kunnen worden verkregen door het vertalen van de belichtingskop langs de trage as om een ​​volumetrisch image, die kan worden bekeken in een directe 3-D weergave of in een 2-D projectie maximale amplitude (MAP) beeld vormen .

2. Systeem uitlijning

1. Gebruik puls-echo echografie en een ultrasone reflector om de positie van de akoestische focal plane (dat wil zeggen, de vertraging van de trigger signaal naar de maximale puls-echo ultrasoon signaal) te bepalen. Deze stap is nodig om slechts eenmaal worden uitgevoerd wanneer de bouw van de OR-PAM-systeem.
2. Maximaliseer de koppeling efficiëntie van de single-mode fiber.
3. Toe te passen ultrasone gel op de top van een optisch absorberende object (bijvoorbeeld een stukje zwart tape) en voorzichtig het te hechten onder de beeldvorming raam in de petrischaal gevuld met gedemineraliseerd water.
4. Laat de beeldvorming hoofd in het water, en verwijder de luchtbellen gevangen onder de akoestische lens.
5. Stel de belichtingskop totdat het fotoakoestische signaal van de absorberende object is van de akoestische focal plane, die kan worden beoordeeld van de akoestische vertraging.
6. Stel de verticale positie (dat wil zeggen, z positie) van de microscoop doelstelling om de amplitude van het signaal fotoakoestische gegenereerd uit de vlakke object te maximaliseren. De maximale signaal amplitude suggereert dat de optische focus is afgestemd op de akoestische focus in de verticale richting.
7. Pas de horizontale positie (dat wil zeggen, x en y posities) van de microscoop objectieve totdat het fotoakoestische signaal gegenereerd uit de doelgroep toont een symmetrisch patroon. De symmetrie suggereert dat de optische focus is afgestemd op de akoestische focus in de horizontale richting.
8. Herhaal de stappen 2.6 en 2.7 totdat het fotoakoestische signaal is geoptimaliseerd, zowel in symmetrie en amplitude.

3. Een sa mple experimentele procedure-in vivo OR-PAM van de muis oor vasculatuur

1. Deze stap is niet vereist voor naakt muizen. Verdoven het dier met een intraperitoneale injectie van een cocktail [recept: 1 ml ketamine (100 mg / ml), 0,1 ml xylazine (100 mg / ml) en 8,9 ml fysiologische zoutoplossing; dosering: 0,1 ml/10 g]. Scheer het haar in het oor, en verder de resterende haren ontharen met Surgi Cream (categorie #: 82565, American International Industries) voor het schoonmaken met gedemineraliseerd water. Merk op dat een dergelijke ontharen enigszins kan de huid irriteren en vaatstelsel dus is het best uitgevoerd 24 uur voor de geplande experiment.
2. Zet het fotoakoestische lasersysteem en controleer het systeem uitlijning.
3. Verdoven van de muis met 3% isofluraan verdampt door de inademing gas (de typische debiet is 1,0-1,5 l / min, afhankelijk van het lichaam van het dier gewicht), en onderhouden van de anesthesie met 1% isofluraan gedurende het experiment. Medische kwaliteit lucht wordt aanbevolen als de inhalatie gas naar de muis op de normale fysiologische status.
4. Breng de muis naar een stereotactische podium, en controle op de lichaamstemperatuur bij 37 ° C met een verwarmingselement.
5. Plat met de muis oor op een plastic bord en breng een laag van ultrasound gel op de top van het oor. Voorkomen dat luchtbellen in de gel. Plaats dan het oor onder de beeldvorming raam en langzaam het dierlijke stadium te verhogen tot het ultrasone gel contact op met de onderkant van de polyethyleen membraan. Zachte contact is nodig omdat het indrukken van de oor tegen de membraan kan bloedstroom beïnvloeden in het oor.
6. Klem een ​​pulsoxymeter om de muis te been of staart aan zijn fysiologische status controleren, en pas zalf voor de ogen droog en accidentele schade aan de laser muis ogen te voorkomen.
7. Laat de belichtingskop tot de akoestische lens is ondergedompeld in gedemineraliseerd water, en verwijder de luchtbellen gevangen onder de akoestische lens.
8. Controleer of de laser Fluence om te zorgen dat binnen de laser veiligheidsnormen van de American National Standards Institute ^13. De laser Fluence mag niet meer dan 20 mJ / cm ^2, wat zich vertaalt in 80 nj van laser puls energie wanneer de laserstraal is gericht op 150 um onder het huidoppervlak.
9. Stel de laser op de externe-trigger mode en start proef scannen. Pas de z-positie van de beeldvorming hoofd tot de sterkste fotoakoestische signaal is van de akoestische focal plane.
10. Stel de juiste parameters en het scannen begint formeel beeld overname.
11. Na het experiment, schakelt u de laser, tilt u de beeldvorming hoofd uit het gedeïoniseerd water, hoe lager het dier tot en met de muisknop loslaat, het reinigen van de muis oor met gedemineraliseerd water, schakelt u de narcose en de temperatuurregelaar en lossen van de muis van het stereotactische podium.
12. Als repetitieve beeldvorming nodig is, zet de muis in een incubator met de omgevingstemperatuur ingesteld op 37 ° C. Zet de muis om het dier faciliteit na het wakker natuurlijk. Anders volgt u de dieren protocollen euthanatize en gooi het.

4. Functionele of-PAM van de totale concentratie en de zuurstofverzadiging van hemoglobine

1. Oxyhemoglobine (HBO ₂₎ en deoxyhemoglobine (HbR) zijn de twee belangrijkste vormen van hemoglobine, de belangrijkste endogene fotoakoestische bron in het zichtbare spectrum. HBO ₂ en HbR hebben verschillende optische absorptie spectra en kan dus spectraal worden gedifferentieerd om zowel de totale concentratie (HBT) en zuurstofsaturatie (SO ₂₎ van hemoglobine ⁵ kwantificeren. Hier zijn twee richtlijnen om te helpen kiezen de juiste optische golflengten voor SO ₂ metingen:
2. Golflengtes moeten worden geselecteerd binnen de Q-band van het hemoglobine absorptiespectrum (dat wil zeggen, 550-600 nm) om een ​​voldoende signaal-ruisverhouding en adequate penetratie te verzekeren.
3. Golflengten waar de absorptie coëfficiënten van de HBO ₂ en HbR hebben een uitgesproken verschil (bijvoorbeeld HbR-dominant 561 nm en hbo _2-dominante 578 nm) worden aanbevolen.

Naast de SO _2, kan HBT worden berekend door het toevoegen van [HbR] en [HBO _2] samen, of het kan direct worden gemeten op isosbestic golflengten van de molaire extinctiecoëfficiënt spectra van hemoglobine (bijvoorbeeld 530 nm, 545 nm, 570 nm, en 584 nm) ^14, waar de HbR-en _hbo-2 hebben dezelfde molaire extinctie coëfficiënten.

5. Representatieve resultaten:

Weergegeven in figuur 1 is de vasculaire anatomie en SO ₂ in een levend naakt muis oor afgebeeld door de dual-golflengte (561 en 570 nm) OR-PAM. De typische beeldacquisitie tijd voor dual-golflengte sO ₂ metingen van een dergelijke regio van belang (beeldgrootte: 10 mm x 10 mm; stap grootte: 2,5 micrometer x 5 micrometer) is ~ 80 min..

p_upload/2729/2729fig1.jpg "alt =" Afbeelding 1 "/>
Figuur 1. In vivo optische resolutie fotoakoestische microscopie. Kaartbeelden van (A) de totale hemoglobineconcentratie met de vasculaire anatomie (verworven bij 570 nm) en (B) de hemoglobine zuurstofverzadiging (verworven op 561 nm en 570 nm) in een naakt muis oor. (C) Close-up van de boxed regio in paneel (A). De schaal bar in paneel (A) geldt voor beide (A) en (B).

Discussie

In deze video geven we een gedetailleerde instructie over de experimentele protocollen van OR-PAM, met inbegrip van de systeemconfiguratie, systeem uitlijning en typische experimentele procedures. Label-free, niet-invasieve OR-PAM heeft ingeschakeld studies van microvasculaire functioneren en de stofwisseling op een enkele capillair basis en daardoor heeft het potentieel om uit te breiden ons begrip van de microcirculatie-gerelateerde fysiologie en pathologie. Microphotoacoustics is op dit moment de productie dit OR-PAM...

Materialen