In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

Samenvatting

Een minimaal invasieve protocol om de muis te wervelkolom te stabiliseren en uit te voeren repetitieve In vivo Ruggenmerg beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie wordt beschreven. Deze methode combineert een spinale stabilisatie-apparaat en een verdoving regime aan de luchtwegen veroorzaakte bewegingen te minimaliseren en de productie van ruwe beeldgegevens dat er geen uitlijning of andere post-processing nodig.

Samenvatting

In vivo beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie ¹ in muizen die genetisch zijn gemanipuleerd om fluorescerende eiwitten uit te drukken in specifieke celtypen ^2-3 aanzienlijk verbreed onze kennis van fysiologische en pathologische processen in een groot aantal weefsels in vivo ^4-7. In studies van het centrale zenuwstelsel (CZS), is er sprake van een brede toepassing van in vivo beeldvorming in de hersenen, die heeft geleid tot een overvloed aan nieuwe en vaak onverwachte bevindingen over het gedrag van cellen zoals neuronen, astrocyten, microglia, onder fysiologische of pathologische condities ^8-17. Echter, veelal technische complicaties beperkt de uitvoering van de in vivo beeldvorming in studies van de levende muis ruggenmerg. In het bijzonder, de anatomische nabijheid van het ruggenmerg naar de longen en het hart genereert belangrijke beweging artefact dat maakt beeldvorming van de woonkamer ruggenmerg een uitdagende taak. We ontwikkelden een nieuwe methode die de inherente beperkingen van het ruggenmerg imaging overwint door het stabiliseren van de wervelkolom, waardoor de luchtwegen veroorzaakte bewegingen te creëren, waardoor het gebruik van twee-foton microscopie aan het imago van de muis ruggenmerg in vivo. Dit wordt bereikt door het combineren van een op maat gemaakte spinale stabilisatie-apparaat met een methode van diepe verdoving, wat resulteert in een significante vermindering van de luchtwegen veroorzaakte bewegingen. Deze video laat zien hoe protocol aan de kaak een klein gebied van de levende ruggenmerg die kan worden gehandhaafd onder stabiele fysiologische omstandigheden gedurende langere tijd door het houden van weefselbeschadiging en bloeden tot een minimum. Vertegenwoordiger van RAW-afbeeldingen verworven in vivo detail in hoge resolutie de nauwe relatie tussen microglia en de bloedvaten. Een timelapse sequentie toont het dynamisch gedrag van microglia processen in de levende muis ruggenmerg. Bovendien is een continu scannen van dezelfde z-frame aan te tonens de uitstekende stabiliteit die deze methode kan bereiken stapels van beelden en / of timelapse films die niet nodig beelduitlijning na de overname te genereren. Tot slot laten we zien hoe deze methode gebruikt kan worden om opnieuw en Reimage hetzelfde gebied van het ruggenmerg op latere tijdstippen, waardoor voor longitudinale studies van lopende fysiologische of pathologische processen in vivo.

Protocol

1. Het bouwen van de spinale stabilisatie-apparaat

1. Bestel de Narishige STS-A Compact Spinal Cord klemmen en de Narishige MA-6N head holding adapter.
2. Op maat ontwerpen en maken een roestvrij stalen bodemplaat om de twee delen Narishige te houden op een lijn, zodat het dier het hoofd wordt ondersteund, terwijl de wervelkolom en de staart zijn geklemd. Houd er rekening mee dat het gehele apparaat moet onder de microscoop lens past meestal op een verlaagd microscoop podium.

2. Dier een operatie

1. Verwarm de microscoop kamer met een luchtverwarming apparaat en handhaven bij 37 ° C.
2. Weeg het dier en....

Discussie

De hier beschreven methode zorgt voor een stabiele en repetitieve in vivo beeldvorming van dichtbevolkte TL-cellulaire structuren in het ruggenmerg van verdoofde muizen met behulp van twee-foton microscopie. De bereikte stabiliteit is een gevolg van een custom-made spinale stabilisatie-apparaat en een verdovingsmiddel regime dat de luchtwegen veroorzaakte beweging artefact vermindert. De spinale stabilisatie-apparaat laat ademen ruimte onder de muis lichaam en kan worden gebouwd met behulp van commercieel verkr.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1841	70 kDa, verdund in ACSF (3% w / v)
Ketamine HCl	Bionichepharma	NDC No: 67457-001-10	Injecteerbare, 50mg/ml
Anased	Lloyd Labs	NADA No: 139-236	Xylazine injecteerbare, 20mg/ml
Acepromazine	Vedco	NADA No: 117-531	Injecteerbare, 10mg/ml
Kunsttranen zalf	Phoenix farmaceutisch	NDC No: 57319-760 - 25	Smeermiddel
Betadine	Visser	19-061617
McPherson-Westcott Schaar	Wereld Precision Instrumenten	555500S	Gebogen, stompe-tip schaar
Rechte Forceps	Wereld Precision Instrumenten	555047FT	Getande tip tang
Klein schip uitbranden	Fine Science Tools	18000-00
Gelfoam	Pharmacia, Pfizer Inc	Mixer Mill MM400
Compact ruggenmerg klemmen	Narishige	STS-A
Hoofd houden adapter	Narishige	MA-6N
Gelseal	Amersham Biosciences Corp	80-6421-43
Lactaat Ringers	Baxter Healthcare	2B8609
Buprenex	Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc	NDC No: 12496 - 6757-1	Buprenorfine, injecteerbare
Baytril	Bayer	NADA 140-913	Enrofloxacin, antibacteriële injecteerbare 2,27% (20ml)
Verwarming pad - Grote	Fine Science Tools	21060-10